Ингибиторная бумага: Ингибиторная бумага — ЗАО МостНИК-ЗИРАСТ

Ингибиторная бумага — ЗАО МостНИК-ЗИРАСТ

Коррозия – проблема, с необходимостью решения которой сталкивается каждый, кто имеет дело с металлами. Процесс окисления, в зависимости от ряда факторов, может протекать с разной скоростью. Сравнительно медленно в сухом теплом помещении, существенно активнее во время перевозки по морю (соль и повышенная влажность). Оставленный без должного присмотра металл вначале потускнеет, затем покроется слоем ржавчины, а после, если своевременно не предпринять соответствующие меры, превратится в труху. Одним из наиболее эффективных и простых методов защиты металлов от коррозии является использование упаковочных материалов с ингибиторами коррозии, например, ингибиторной бумаги.

Ингибиторная бумага, или как еще называют антикоррозийная упаковочная бумага – относительно недорогой и при этом достаточно весьма надежный метод защиты изделий из черных и цветных металлов от коррозии. Своим антикоррозийным свойствам бумага обязана содержащимся в ее составе летучим ингибиторам коррозии (ЛИК), создающими на поверхности металлов особую защитную пленку, делая ее устойчивой к воздействию коррозийных факторов.

Как и любой другой продукт, ингибиторная бумага обладает определенными плюсами и минусами. К ее преимуществам можно отнести низкую стоимость и простоту процесса упаковки по сравнению с традиционными методами защиты (консервационные масла, силикагели и т.п.) и отсутствие в ее составе веществ, вредных для здоровья. К недостаткам (если сравнивать ее с упаковочными пленками) — достаточно низкую прочность, недолговечность, непрозрачность и набор влаги из окружающей среды. Упакованное в ингибиторную бумагу изделие будет защищено от коррозии приблизительно на два года, против 3-10 при использовании пленок. Использование нашей фирмой современных водоотталкивающих пропиток и высококачественной бумаги позволяют свести к минимуму недостатки ингибиторной бумаги, но не устранить их полностью.

Купить ингибиторную бумагу, или какой-либо другой тип антикоррозийной упаковки вы можете, позвонив в наш центральный офис в Москве по тел. +7 (495) 330-57-33 или +7 (495) 330-26-68.

По желанию заказчика наша компания осуществляет доставку купленного товара (через транспортные компании) в любой город России, в частности: Нижний Новгород, Санкт-Петербург, Самара, Екатеринбург, Саратов, Новосибирск, Челябинск, Казань, Ростов-на-Дону, Омск, Уфа, а также многие другие.

Ингибированная бумага для защиты от коррозии

Ингибированная бумага для защиты от коррозии

А антикоррозийная бумага годится скорее для обертывания конструктивных элементов, механизмов и деталей при перевозке и хранении в различных условиях на короткий период. В то же время наша антикоррозийная пленка способна обеспечить именно эффективную защиту на долгие годы.

Преимущества упаковки в ингибированную бумагу:

Безусловно, более дешевым вариантом упаковки будет тот, в котором используется ингибированная бумага. Она, в отличии от синтетики, дерева и прочих материалов действительно недорогая. А после пропитки ее поверхности ингибитором такая бумага становится недорогим и надёжным материалом для защиты металлической продукции, обеспечивая ее сохранность в условиях риска поражения коррозией. Однако, бумага недолговечна, в отличии от предлагаемой нашей компанией антикоррозийной пленки.

ОСТАВЬТЕ ЗАЯВКУ НА ОБРАЗЦЫ И ОТЗЫВЫ

Однако, ингибированная бумага обладает некоторыми положительными характеристиками:

• сочетает в себе качества материалов для консервирования и упаковки;
• защищает сложные металлические изделия от разрушения коррозией;
• не требует применения смазок для перевозки и хранения;
• простой процесс удаления упаковки, без необходимости расконсервирования изделий.

Виды ингибированной (антикоррозийной) бумаги

Сейчас рынок изобилует предложениями поставок этого упаковочного материала. Потому, в процессе выбора материалов для прослойки наши специалисты, в первую очередь, обращают внимание на:
1. срок использования (действия) ингибиторного вещества;
2. технико-экономические параметры бумаги;
3. тип сохраняемого или транспортируемого металла.

Но, поскольку для упаковки лучше использовать именно антикоррозийную пленку, то следуя за потребностями наших покупателей мы подбираем ее так, чтобы гарантировать максимальную защиту чугунной, алюминиевой и стальной продукции от нежелательного внешнего воздействия, чего нельзя обеспечить в случае с применением бумаги.

Эффективна ли будет защита антикоррозийной бумагой, во многом зависит и от того, насколько аккуратно перевозят и хранят металлическую продукцию. Что же касается использования в качестве упаковочного материала антикоррозийной пленки, то она менее прихотлива и более вынослива к внешним повреждениям.

И, к слову, бумага не всегда используется в качестве упаковки. Чаще ее имеет смысл использовать именно как прослойку между основными упаковочными материалами и металлическими изделиями. Ведь даже высококачественная ингибированная бумага будет посредственной защитой и хранителем ингибитора. Потому, мы рекомендуем использовать именно антикоррозийную пленку. Она предотвратит любое механическое повреждение продукции вследствие трения и защитит ее от воздействия прочих негативных факторов А наши специалисты подберут подходящий именно для вашей продукции тип антикоррозийной пленки.

Кроме того, ингибированная пленка отлично защищает и консервирует металлические крепёжные элементы, листовую сталь, и даже проволоку. В такой упаковке изделия этих типов будут отлично храниться довольно длительное время, в то время как антикоррозийная бумага обеспечивает защиту на протяжении менее двух лет. Потому, если вы планируете долгосрочное хранение, то мы подберем антикоррозийную пленку именно под ваши требования. И даже подскажем вам, как лучше упаковать вашу продукцию, к перевозке и хранению которой выдвигаются особые требования. Это может пригодится для товаров отправляемых, например, на экватор, в тропики или же на крайний север.

Ингибиторами для антикоррозийной бумаги могут выступать:
• УНИ;
• БН;
• БМЭА;
• БТА;
• Г-2;
• М-1;
• циклогексиламин;
• нитробензойнокислый;
• дициклогексиламин;
• динитробензойнокислый и т.д.

Ну а наш богатый опыт показывает, что наибольший спрос у наших заказчиков имеет бумага с ингибитором УНИ. И сейчас гиганты металлообрабатывающей отрасли изготавливают ее своими силами, для личного пользования. При этом они сами регулируют объем ингибиторов. Такая бумага может прослужить относительно недолго, в то время, как предлагаемая нами антикоррозийная пленка, материал долговечный – активен до 3х лет.

Ну а самыми важными параметрами, определяющими сроки использования бумажных листов УНИ является соответствие параметров материалов нормативно-технической базе, в том числе:

• объемы ингибиторов;
• уровни паропроницаемости;
• условия транспортировки и использования;
• наличие и тип защитного слоя.

Но, чтобы ингибитор служил долго, перед началом консервации металлической продукции ее поверхности необходимо подготовить специальным образом, чего не нужно делать в случае использования нашей антикоррозийной пленки. А значит, выбирая такую пленку вы сэкономите и время, и деньги. Для получения более подробной информации по всем интересующим вас вопросам свяжитесь с представителями нашей компании. И мы с радостью вам поможем.

Прямо сейчас оставьте заявку на сайте или задайте вопрос консультанту в окошке справа. Мы привезем вам образцы наших материалов и предоставим акты и отзывы других предприятий.

cor.su — Ингибированная бумага

Наше предприятие предлагает ингибированную бумагу нового поколения. Что такое ингибированная бумага и чем отличается ее новое поколение? Бумага – хороший и привычный упаковочный материал; ингибированная бумага – композиционный материал, состоящий из бумаги-основы и внедренного летучего ингибитора коррозии (ЛИК), который не образует химических соединений с основой. ГОСТ 16295-93 регламентирует использование ряда марок противокоррозионных бумаг (марок МГБИ, БН, УНИ), однако практика их применения выявила ряд недостатков. Во-первых, в качестве основы использовалась бумага низкого качества, упакованные изделия после транспортировки были покрыты слоем обрывков, а не упакованы. Во-вторых, в качестве основы использовалась бумага очень низкого качества, она слишком быстро набирала влагу. В-третьих, бумага, пропитанная ЛИК, на первом этапе выделяет большое количество ЛИК, однако по мере впитывания бумагой влаги из окружающей среды, этот поток ослабевает, при определенном насыщении бумаги влагой инициируется питтинговая коррозия металла. В-четвертых, дополнительные влагоотталкивающие пропитки бумаги делали ее непригодной к вторичной переработке, что усложняло ее утилизацию. Именно устранение перечисленных недостатков позволяет назвать предлагаемую ингибированную бумагу инновационным продуктом нового поколения.

Ингибированная бумага VpCI-144 предназначена для упаковки и защиты от коррозии металлических изделий. Содержит водоотталкивающую пропитку, она значительно более влагостойка, чем ранее выпускавшиеся виды бумаги. Значительно уменьшена неравномерность во времени процесса испарения содержашегося в бумаге ЛИК, что увеличивает срок ее службы, срок воздействия на упакованные в бумагу детали. Современная ингибированная бумага стала существенно более эффективным упаковочным и защитным материалом, чем раньше.

Ингибированная ламинированная бумага VpCI-146 изготавливается из высококачественной бумаги, структура которой создает условия для равномерного испарения ингибиторов коррозии, входящих в состав технологических пропиток. Ингибированная бумага изготавливается таким образом, что с одной стороны на ее поверхность нанесена водоотталкивающая пропитка, химический состав которой позволяет, в отличие от бумаг с полиэтиленовым или вощеным водоотталкивающим покрытием проводить утилизацию использованной бумаги по традиционным технологиям вторичной переработки.

Silverbrite — специальная бумага для защиты серебра, меди и латуни. Содержит поглотитель сероводорода, по мере использования меняет цвет.

Антистатическая ингибированная бумага VpCI-145. Разработана специально для изделий электро- и электронной промышленности. В дополнение к ингибиторам содержит добавку, способствующую снятию статического заряда.

Corpak — упаковочный картон с ЛИК. Является не только надежным упаковочным материалом с функцией защиты от коррозии, но и весьма экологически эффективен, позволяет вторичную переработку без ограничений.

Порно мужчины по вызову

Ингибированная бумага как упаковочный антикоррозийный материал

Ингибированная (противокоррозионная) бумага используется для упаковки и служит средством защиты металлоизделий, созданных из цветных и черных металлов, от коррозии. Она является основой, куда наносят ингибитор, испаряющийся во время эксплуатации и покрывающий поверхность изделий из металла мономолекулярным слоем ингибитора. Данный вид бумаги применяют в различных сферах промышленности как способ консервации или для защиты элементов, деталей и механизмов в процессе транспортировки, хранении при разных условиях окружающей среды.

Выгода от применения упаковочного материала

Для упаковки выгоднее применять бумагу, чем синтетику, древесину или иные материалы, а пропитка специальным веществом, ингибитором – несложная и недорогая процедура, при этом позволяющая надежно консервировать продукцию из металлов.

Главные преимущества данного вида упаковочного материала:

• объединяет характеристики простого упаковочного и консервационного материала;
• подходит для защиты сложных металлических изделий от коррозии;
• позволяет отказаться от использования смазочных материалов в процессе транспортировки и хранения;
• упаковка без труда снимается и изделие не требует расконсервации.

Какой бывает ингибированная(антикоррозионная) бумага?

Среди большого количества предложений на рынке нужно выбрать упаковочную ингибированную (антикоррозионную) бумагу. Важно смотреть на период эксплуатации (действия) ингибитора, технико-экономические свойства материала, вид металла, который хранится или транспортируется. При грамотном подборе упаковки продукция из стали, алюминия, чугуна будут спасены от пагубного воздействия окружающей среды.

Эффективность антикорозионного материала зависит от того, как осуществляется транспортировка и хранение изделий. Материал не во всех случаях служит упаковкой, поскольку может являться и промежуточным слоем между главной упаковкой и изделием из металла. Качественная бумага надежно защищает и долго сохраняет ингибитор. Также она не допускает механического повреждения сохраняемого или транспортируемого изделия. Согласно технической документации для разных видов металлических изделий подбирается нужный тип упаковки.

Ингибированная бумага незаменима для защиты и консервации металлических элементов крепежа, а также для проволоки, листовой стали. В ней данные изделия разрешается хранить до двух лет, а иногда и более.

Для обеспечения надежной защиты одного или другого металлоизделия специально разрабатывают материал для упаковки, метод или специальную тару. Часто это нужно при отправке товара в жаркие места с высокой влажностью либо для хранения в агрессивных условиях.

Ингибитором для бумаги служит УНИ, БН, БМЭА, БТА, Г-2, М-1, циклогексиламин, нитробензойнокислый, дициклогексиламин, динитробензойнокислый и т.д. Наибольшую популярность получил материал с ингибитором УНИ.  Большие металлообрабатывающие предприятия производят его самостоятельно. При выпуске регулируется количество ингибитора. Так, специальная бумага может иметь период службы от 10 до 15 лет.

Наиболее весомые критерии, влияющих на длительность эксплуатации листов целлюлозы УНИ, — соответствие показателей материала нормативно-технической базе, включая объем ингибитора, паропроницаемость, условия применения и транспортировки, присутствие и тип барьерного слоя. Для получения максимального периода действия защитного состава поверхность металлопродукции специально подготавливают до начала консервации.

Бумага противокоррозионная УНИ

Бумага упаковочная противокоррозионная УНИ 14 -80

предназначена для защиты изделий из черных металлов от атмосферной коррозии.

В обозначении марки бумаги первые три буквы указывают вид ингибитора, первая цифра указывает содержание ингибитора в граммах в 1м2 бумаги, вторая — массу 1м2 применяемой бумаги-основы.

Для изготовления бумаги применяется бумага-основа, выработанная из 100%сульфатной небеленой целлюлозы, и уротропино-нитритной ингибитор. Обеспечивает защиту изделий без консервации на срок 1 -Улет в зависимости от вариантов упаковки и условий хранения по ГОСТ 9.014. Обладает динамической прочностью, гибкостью, растяжимостью, мягкостью и эластичностью.

Малотоксичная, но при контакте с кожей может вызвать раздражающее действие. Изготовляется в рулонах шириной 600 -1200мм., массой 200- 250 кг.

Бумага противокоррозионная УНИ 22-80 

предназначена для защиты металлоизделий, изготовленных из чёрных и цветных металлов, от атмосферной коррозии.

Характеристики бумаги:

 В 1 кг.  примерно 9 метров бумаги.

 Ширина рулона            105 см.

 На ощупь          Немного шершавая

Описание

Противокоррозионная бумага (ГОСТ 16295-93) — это упаковочная бумага, являющаяся средством защиты металлоизделий, изготовленных из чёрных и цветных металлов, от атмосферной коррозии.

Состоит из бумаги-основы, на которую нанесено функциональное вещество – ингибитор атмосферной коррозии металлов, который в процессе эксплуатации испаряется из бумаги и покрывает поверхность металлоизделия тонким мономолекулярным слоем ингибитора (отсюда и название ингибированная бумага), включая внутренние объёмы, стыки, зазоры, защищая, таким образом, поверхность металла от коррозии, вызванной действием влаги.

Противокоррозионная ингибированная бумага применяется во многих отраслях промышленности как средство консервации, а также для защиты изделий при транспортировке и хранении в различных климатических зонах и условиях.

  Бумага предназначена для защиты от коррозии изделий из черных металлов и сплавов (стали как без покраски, так и с неметаллическими покрытиями, никеля, хрома без подслоя меди), за исключением чугуна.

  Обеспечивает защиту изделий на длительные сроки хранения: от 3 до 7 лет при варианте упаковки ВУ-5, ВУ-6  и от года до двух лет при варианте упаковки ВУ-1 . Изготавливается без полимерного покрытия, в рулонах шириной от 1170 до 1250 мм. Масса рулона 200-250 кг. Масса одного м2 бумаги 115 ± 10 г, содержание ингибитора в 1 м2 не менее 22 г, степень крепирования не менее 5%. За счёт крепирования значительно улучшены деформационные свойства бумаги.

Бумага противокоррозионная УНИ 35-80 ГОСТ 16295-82

применяется для длительной противокоррозийной защиты изделий из черных и цветных металлов от воздействия влаги.   Бумага противокоррозионная представляет собой пропитанную или кашированнную бумагу. Благодаря выделению паров соответствующих веществ или непосредственному контакту противокоррозийная бумага защищает упакованную продукцию от коррозии.   Бумага противокоррозионная относится к классу упаковочных бумаг, превосходно обеспечивает надежную защиту металла от коррозии.   Масса рулона до 200кг, ширина 1050мм; 1250мм.

    Показатели качества бумаги должны соответствовать следующим нормам:

1 .Масса ингибитора в бумаге площадью 1 м2, г, не менее: УНИ-22-80 — 22,0; УНИ-14-80 — 14,0.

2.Влажность, %, не более 12,0.

   Бумага должна изготовляться в рулонах шириной 1200 ; 1240 мм. Предельные отклонения по ширине рулона — + 20 мм.

   Масса рулона должна быть 200 -250 кг.

   По согласованию с потребителем допускается изготовлять бумагу в рулонах другой ширины и массы.

   Не допускается осыпание ингибитора с поверхности бумаги, дырчатость, механические повреждения, металлические и минеральные включения.

 Количество обрывов в рулоне не должно превышать трех. Места обрывов должны быть отмечены цветными сигналами, видимыми с торца рулона.

Характеристика исходного сырья и материалов.

   Бумага-основа является горючей. Воспламеняется под воздействием открытого огня.

 Нитрит натрия токсичен, негорюч, пожароопасен, является окислителем. Способствует сомовозгоранию горючих материалов. Взаимодействие нитрита натрия с горючими веществами может сопровождаться взрывом.

 По степени воздействия на организм относится к веществам 1-го класса опасности по ГОСТ 12.1.005.-88 (вещество чрезвычайно опасное). Способен раздражать кожу и слизистые оболочки. Возможно проникновение через неповрежденную кожу. Предельно допустимая концентрация (ПДК) нитрита натрия в воздухе рабочей зоны — 0.1 мг мЗ.

Уротропин технический — малотоксичное вещество 3-го класса опасности .При попадании на кожу оказывает резко раздражающее действие, иногда вызывает экзему с сильным зудом.,быстро проходящее после прекращения работы с ним.

ПДК пыли уротропина в воздухе рабочей зоны производственных помещений 9 мг/мЗ.

Уротропин — горючее вещество. Осевшая пыль пожароопасна. Тушить распыленной водой или пеной.

     Описание технологического процесса.

Технологический процесс изготовления противокоррозионной бумаги включает следующие стадии:

-приготовление рабочего раствора ингибитора

-пропитка бумаги-основы раствором ингибитора

-сушка бумаги

 -упаковка, маркировка и хранение

Ингибиторная пленка или ингибированная

В современных условиях возрастают требования к коррозионной стойкости и долговечности конструкций и механизмов, крепежных изделий, упаковке оборудования. Самым востребованным материалом для защиты черных и цветных металлов от неблагоприятных факторов окружающей среды являются сегодня ингибиторная пленка.

Ее используют для консервации продукции при хранении, перевозки на дальние расстояния (особенно морским транспортом), защиты в сложных температурных или климатических условиях, при повышенной влажности в местах складирования, работе под открытым небом и др.

Защита от ржавчины

Поверхность металлов под влиянием физико-химических факторов окружающей среды подвергается коррозии (от лат. corrodo, что означает «грызу»). При этом металл окисляется, вызывая появление различных химических соединений (окислы, карбонаты, гидроокиси и т. д.) и теряя свои свойства. Появляющиеся при этом следы ржавчины могут привести к выходу конструкций и оборудования из строя.

В начале прошлого века было выяснено, что защитить металлы от воздействия окружающей среды способны химические соединения, находящиеся в газообразном состоянии. Их назвали летучими ингибиторами и стали использовать для временной зашиты металлов от коррозии. Сегодня на рынке существуют уже новые поколения этих веществ. Они нетоксичны, не имеют запаха, безопасны для здоровья человека. Их можно использовать при упаковке пищевых продуктов.

Принцип действия

Существует несколько видов летучих ингибиторов коррозии (ЛИК), имеющих разные технические характеристики. В английском языке эти химические соединения получили название VpCI (Vapor Phase Corrosion Inhibitor). Принцип их действия заключается в следующем: изделие покрывается пленкой, которая выделяет пары ингибитора, заполняя все пространство внутри упаковки и создавая защитную газовую среду вокруг деталей, конструкций.

На металлической поверхности ЛИК конденсируются и образуют мономолекулярную пленку, которая и препятствует появлению коррозии. Поскольку эти соединения находятся в газообразном состоянии, они легко проникают в любые щели и полости, обеспечивая защиту в самых труднодоступных местах. Это является главным преимуществом при использовании ингибированных материалов, содержащих летучие соединения. Защитное действие осуществляется на расстоянии до 70 см от пленки.

Для того чтобы ингибиторы эффективно действовали, необходимо герметично упаковать изделие. Для скрепления полотен мы рекомендуем применять специализированный скотч LK-7535 или применять термосварку.

Ингибиторные пленки, содержащие ЛИК, используют сегодня в различных отраслях промышленности. Они позволяют совместить антикоррозийную защиту и консервацию металлических конструкций, в том числе очень больших размеров. Ингибиторная пленка сокращает затраты на упаковку оборудования, она удобна в применении. После ее удаления все части и механизмы будут сразу готовы к использованию, никакой дополнительной очистки не потребуется. Обычные средства защиты: воск, масла, смазки, парафинированная бумага, жидкие ингибиторы стоят значительно дороже или требуют времени, физических затрат при нанесении и последующей очистке.

Состав и технологии

Ингибиторная пленка содержит полимеры и комплексные ингибиторы коррозии ЛИК. Метод изготовления основан на экструзии полимерной основы, которая обеспечивает связь всех компонентов. Существуют разные технологии получения ингибиторных пленок. Наиболее распространен метод рукавной экструзии. Полимер смешивают с пластификатором, а затем в полость рукава нагнетают пары летучего соединения. Введение последнего является ключевым моментом всей операции. ЛИК распределяются равномерно в пленке, растворяясь в пластификаторе, в качестве которого выступают высоковязкие контактные ингибиторы.

Пленка имеет барьерный слой, что препятствует выделению газообразных соединений наружу, студнеобразный слой, содержащий ингибитор ЛИК, и регулирующий слой, ограничивающий чрезмерное испарение внутрь упаковки.

Ингибиторная пленка LIKKOR выпускается в виде полотна, рукава, полурукава, рукава с фальцами.

Реквизиты ООО ИнвестБумага

Amazon.com: Daubert Cromwell UW409X9CUT Ингибитор коррозии Uniwrap Вырезанный лист крафт-бумаги VCI, длина 9 дюймов x ширина 9 дюймов (упаковка из 500 шт.): Office Products

В настоящее время недоступен.
Мы не знаем, когда и появится ли этот товар в наличии.

• Убедитесь, что это подходит
  введя номер вашей модели.
• Упаковочная бумага с ингибитором коррозии для многометаллических деталей и узлов

• 40 фунтов крафт-бумаги VCI, разрезанной на удобные листы длиной 9 дюймов и шириной 9 дюймов

• Идеально подходит для ручной упаковки металлических деталей и запчастей

• Сохраняет металлические поверхности чистыми, сухими, без ржавчины и готовыми к использованию

]]>

Характеристики данного продукта

VCI Paper, VCI Treated Paper

Универсальный ассортимент бумаги Cortec с VCI-покрытием предлагает множество возобновляемых, пригодных для вторичной переработки и полностью репульпируемых вариантов защиты от коррозии шириной около 100 дюймов (2.5 м) для штучной упаковки, чередования деталей и т. Д.!

Наша бумага, обработанная VCI, покрыта запатентованными ингибиторами коррозии в паровой фазе для превосходной защиты от коррозии как черных, так и цветных металлов. Эти бумажные изделия, изготовленные из высококачественной нейтральной натуральной крафт-бумаги, не содержат фторсодержащих химикатов, нитритов, фосфатов, силиконов, хроматов или других тяжелых металлов. Бумага Cortec ^® VCI эффективна в агрессивных средах, включая влажность, SO ₂ и H ₂ S.

Мультиметаллическая бумага с VCI

Cortec ^® устраняет необходимость инвентаризации различных видов бумаги для каждого типа металла, который необходимо защитить. Они также предотвращают загрязнение упаковки за счет использования высококачественной нейтральной / натуральной крафт-бумаги. Большинство бумаг с VCI полностью пригодны для вторичной переработки и повторного использования.

Бумага с VCI

Cortec ^® проста в использовании: нет химических концентраций, которые нужно рассчитывать, или систем применения, которые необходимо поддерживать. Просто оберните металлические детали оберточной бумагой VCI и сложите края вместе, чтобы не было свободного воздушного потока.При необходимости используйте липкую ленту, чтобы удерживать складки бумаги на месте. Молекулы VCI в бумажном покрытии испаряются и конденсируются в защитном молекулярном слое на поверхностях металла, заключенного внутри упаковочной бумаги с VCI. Когда компоненты удаляются с бумаги, молекулы VCI естественным образом отплывают от металла, оставляя после себя сухую и готовую к использованию поверхность.

Cortec ^® Бумага VCI включает специальные разновидности, такие как крепированная бумага VCI, усиленная бумага, жиростойкая бумага и бумага ESD.Кроме того, наша влагонепроницаемая бумага, полностью пригодная для вторичной переработки / повторного использования, является отличной альтернативой полиэтиленовой и вощеной бумаге. Бумага, покрытая нашими барьерными покрытиями на водной основе, демонстрирует влагобарьерные свойства, конкурентоспособные по сравнению с традиционными влагонепроницаемыми бумагами с восковым или полиэтиленовым покрытием, с тем преимуществом, что они более экологичны и легче утилизируются.

Как работает VCI Paper

Хлорохин — мощный ингибитор заражения и распространения коронавируса SARS | Журнал вирусологии

Низкомолекулярный ингибитор BamA, непроницаемый для оттока и барьера проницаемости внешней мембраны

Устойчивость к антибиотикам становится все более распространенной.Фактически, в некоторых странах показатели устойчивости к ключевым парам патоген-антибиотик поднялись выше 90% (1), что подчеркивает острую необходимость в разработке новых антибиотиков. Хотя недавние усилия привели к разработке новых антибиотиков, нацеленных на грамположительные бактерии, усилия по открытию антибиотиков для грамотрицательных бактерий были намного медленнее из-за наличия внешней мембраны (ОМ) (2). OM представляет собой асимметричный липидный бислой, состоящий из внешнего листка липополисахарида (LPS) и внутреннего листка фосфолипидов (3).Хотя небольшие гидрофильные молекулы проникают в ОМ через обильные порины, класс β-стволовых белков ОМ (OMP) (3, 4), его уникальная структура делает ОМ непроницаемым как для крупных, так и для гидрофобных молекул (5). Из-за этого барьера грамотрицательные бактерии защищены от многих антибиотиков, к которым чувствительны грамположительные бактерии.

Помимо своей внутренней непроницаемости для антибиотиков, грамотрицательные бактерии могут приобретать высокий уровень устойчивости к антибиотикам через несколько различных генетических механизмов.К ним относятся мутации или приобретение генов, которые изменяют или обходят мишень антибиотика, инактивируют или разрушают антибиотик или вызывают повышенную регуляцию генов, кодирующих оттокные насосы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (6). Из них оттокные насосы MDR являются не только наиболее часто используемыми механизмами устойчивости, но они также обеспечивают защиту от многих антибиотиков одновременно независимо от цели (7).

Одна из стратегий, позволяющих избежать резистентности, обеспечиваемой насосами оттока МЛУ грамотрицательных бактерий, заключается в нацеливании на важные процессы, происходящие на поверхности клетки.Эта стратегия не только свела бы на нет активность насосов, но также предотвратила бы внутреннее сопротивление, создаваемое барьером проницаемости ОВ. Для этого требуется идентификация антимикробных агентов, которые нацелены на основные, экспонируемые на поверхности белки, необходимые для биогенеза ОМ: LptD, компонент трансенвертного комплекса, экспонируемый на поверхности, который перемещает LPS на поверхность клетки, и BamA, экспонируемый на поверхности член сборочная машина β-ствола (комплекс БАМ), отвечающая за сборку ОМП (3, 8).

Предыдущие исследования подтвердили этот подход. Было идентифицировано несколько антимикробных пептидов, которые нацелены на LptD и ингибируют транспорт LPS к поверхности клетки, что приводит к гибели клеток (9, 10). Более того, связывание антител с внеклеточной областью BamA ингибирует биогенез OMP и убивает клетки (11). Недавно была описана небольшая молекула, ингибирующая сборку аутотранспортера. Хотя эта молекула может ингибировать функцию БАМ, цель еще предстоит идентифицировать (12).

Чтобы идентифицировать новые потенциальные антибиотики, нацеленные на эти открытые на поверхности незаменимые белки ОМ, мы провели скрининг малых молекул, которые нарушали барьер ОМ при сублетальных концентрациях и проявляли антимикробную активность против Escherichia coli , которая не снижалась активностью эффлюкса. .Используя эти скрининги, мы идентифицировали соединение, MRL-494, которое ингибирует встраивание OMP в ОМ путем нацеливания на BamA.

Результаты

Идентификация соединения, потенциально нацеленного на ОМ.

Ранее мы описали идентификацию набора соединений, которые ингибировали рост штамма E. coli , дефицитного по оттоку и целостности ОМ (13, 14). Мы предположили, что эта коллекция содержала как соединения, которые ингибируются барьером проницаемости ОМ и / или оттоком, так и соединения, которые могут действовать на клетки дикого типа, минуя эти барьеры.Таким образом, мы стремились идентифицировать биоактивные молекулы в этой коллекции, которые обладали активностью против компетентных по оттоку и проницаемости E. coli . Эти соединения представляют особый интерес, поскольку они, по-видимому, избегают оттока и барьера проницаемости ОВ из-за их химической природы или расположения на поверхности их мишени.

Одно из таких соединений, MRL-494 (рис.1 A ), проявляло почти одинаковую активность против штамма дикого типа, как и штамм с делецией tolC , гена ОМ-канала оттока насоса (15 ) ( SI Приложение , Таблица S1).Поразительно, но это соединение также проявляло антимикробную активность против широкого спектра видов бактерий ( SI Приложение , Таблица S1). Интересно, что MRL-494 был непреднамеренным побочным продуктом, созданным во время синтеза неродственного соединения, и поэтому представлял уникальный хемотип в коллекции для скрининга.

Рис. 1.

MRL-494 нарушает биогенез OMPs. ( A ) Химическая структура MRL-494. ( B ) MRL-494 усиливает действие рифампицина. Были проведены измерения МИК для рифампицина с сублетальной дозой MRL-494 или без нее.( C и D ) Культуры Midlog TJS101, несущие репортер P micA-gfp , обрабатывали MRL-494 при 1 ×, 0,5 × и 0,25 × MIC или контролем DMSO (носитель [Veh]) и выращивают за 1,5 ч. ( C ) Обработка MRL-494 снижает количество OMP. После 1,5 ч обработки клетки собирали, нормализовали до OD и анализировали на содержание белка. Жирной линией обозначены отдельные биологические реплики. Данные представляют 2 независимых эксперимента. ( D ) Обработка MRL-494 приводит к дозозависимому увеличению активности σ ^E .Последующую обработку флуоресценции GFP измеряли как репортер активности σ ^E и нормализовали до OD600. Данные представлены как среднее значение кратности для группы обработки ДМСО ± стандартное отклонение для трех образцов. ( E ) Мутанты OMP-биогенеза демонстрируют повышенную чувствительность к MRL-494. Устойчивость к MRL-494 штаммов с указанной делецией или мутацией на фоне tolC ⁺ анализировали с помощью MIC. Log _{2 показаны изменения в 90-104 раза относительно родительского штамма.Данные представляют 2 независимых эксперимента. ( F ) Лечение батимастатом увеличивает чувствительность к MRL-494. Клетки обрабатывали, как в B и C , и дополнительно обрабатывали батимастатом 0,25 × МИК, где указано. OD600 анализировали после обработки. Данные представлены как среднее значение трех образцов ± стандартное отклонение. ( G ) Биогенез OMP ингибируется MRL-494 и восстанавливается bamA E470K . Культуры Midlog штаммов, экспрессирующих bamA или bamA E470K в гаплоиде дикого типа, обрабатывали ДМСО (Veh), 0.25 × МИК батимастата или 0,25 × МИК батимастата с 0,25 × МИК MRL-494 дикого типа в течение 1,5 часов. Оценивали конформационное состояние и общую численность LamB. Данные представляют 2 независимых эксперимента.}

Затем мы попытались определить, проникал ли MRL-494 1) через клеточную оболочку и был непроницаемым для оттока или 2) нацеливался на процессы, связанные с ОМ. С этой целью мы проверили способность MRL-494 усиливать активность рифампицина, антибиотика, который невосприимчив к оттоку, но не может легко проходить через ОМ E.coli (13). Мы обнаружили, что присутствие сублетальных концентраций MRL-494 вызывает значительное снижение минимально-ингибирующей концентрации (МИК) рифампицина (рис. 1 B ), аналогичное тому, которое наблюдается с аллелем envA101 , мутацией в пределах lpxC ген, который приводит к меньшему количеству LPS в наружной створке и компенсаторному увеличению фосфолипидных двухслойных пятен в OM. Эти данные демонстрируют, что MRL-494 разрушает барьер проницаемости ОМ и позволяет проникать рифампицину, предполагая, что MRL-494 препятствует важному пути, связанному с ОМ.

Возможно, что MRL-494 нарушает проницаемость ОМ посредством механизма, который нарушает липидный состав клетки. Бактерии, несущие мутацию envA101 , не продемонстрировали сдвига в MIC MRL-494 по сравнению с диким типом ( SI, приложение , таблица S1). Точно так же не было сдвига в MIC у штамма Acinetobacter baumannii , лишенного LPS, из-за мутации в гене lpxC . Вместе эти результаты предполагают, что MRL-494 приводит к увеличению проницаемости ОМ, но эта повышенная проницаемость не усиливает токсичность MRL-494 и не позволяет ему более легко проникать через барьер ОМ.Следовательно, MRL-494 может ингибировать важный процесс, связанный с ОМ, мишень которого может быть доступна на поверхности клетки.

MRL-494 ингибирует биогенез OMP.

Чтобы исследовать возможность того, что MRL-494 действует, воздействуя на процессы, связанные с ОМ, мы искали изменения, происходящие в ОМ во время лечения MRL-494, и обнаружили, что количество основных ОМР (BamA, LptD, OmpC, LamB, OmpA ) снижался дозозависимым образом, тогда как уровни цитоплазматических (GroEL) и периплазматических белков (MBP) сохранялись (рис.1 С ). Кроме того, мы также наблюдали соответствующее увеличение уровней периплазматической протеазы DegP. DegP разрушает развернутые OMP, которые накапливаются в периплазме (16), и его экспрессия контролируется стрессовыми реакциями оболочки (17, 18). Это указывает на то, что стрессовый ответ σ ^E , который активируется дефектами биогенеза OMP и LPS (19–23), может быть активирован обработкой MRL-494. Используя репортер GFP, управляемый реагирующим на σ ^E промотором (24), мы наблюдали дозозависимое увеличение активности σ ^E после обработки MRL-494 (рис.1 D ). Вместе эти данные предполагают, что MRL-494 может нацеливаться на биогенез OMP.

Недавно транслированные OMP секретируются в периплазму транслоконом Sec (8, 25) ( SI Приложение , Fig. S1). После секреции OMPs связываются шаперонами (например, SurA) (26) и транспортируются через водную периплазму к гетеропентомерному комплексу BAM (т.е. BamABCDE) (27-30). Комплекс BAM затем сворачивается и вставляет OMPs в OM (8, 27–30). BamA и BamD необходимы, а BamB, BamC и BamE — нет (28–30).Чтобы проверить, может ли MRL-494 ингибировать биогенез OMP, мы сначала исследовали, синергизируются ли мутации потери функции в путях биогенеза OMP с MRL-494. Снижение уровней BamA или удаление bamB вызывало снижение MIC MRL-494 (фиг. 1 E ). Более того, делеция гена либо первичного периплазматического шаперона, ответственного за доставку OMPs в комплекс BAM ( surA ) (26), либо основной протеазы, ответственной за разрушение OMP, которые не могут быть собраны ( degP ) (16), вызывала даже большие сдвиги MIC.

Как упоминалось ранее, система σ ^E , которая реагирует на развернутые OMP в периплазме (19, 22, 23), активируется MRL-494. Индукция этого стрессового ответа увеличивает экспрессию, среди прочего, членов комплекса БАМ, периплазматических шаперонов и периплазматических протеаз (19). Учитывая генетические взаимодействия между MRL-494 и мутациями в генах для членов регулона σ ^E , мы предположили, что активация σ ^E после обработки MRL-494 является защитной.Чтобы проверить эту возможность, мы обработали клетки сублетальными дозами MRL-494 и батимастата, ингибитора активации σ ^E (24). Совместная обработка клеток MRL-494 и батимастатом вызвала дефект роста, который был больше, чем повышенная доза MRL-494 (фиг.1 F ), демонстрируя, что активация σ ^E в контексте обработки MRL-494 является защитный.

Во время сборки обычно используемая модель OMP, LamB, переходит из развернутого состояния в переходное мономерное β-цилиндрическое состояние в конечное тримерное состояние β-цилиндра в OM (31).Мы исследовали частоту этих состояний в присутствии сублетальной дозы MRL-494 и батимастата, которая предотвращает подавление регуляции OMP и повышение регуляции периплазматических протеаз, которое происходит при активации σ ^E (24). После совместного лечения уровни функционального тримера LamB были почти неопределяемыми, тогда как обработка одним только батимастатом не вызвала изменений в образовании тримера (рис. 1 G , см. Дорожки, отмеченные «WT»), что указывает на то, что MRL-494 ингибирует сборку OMP в ОМ.

Современная модель первичной причины смерти после ингибирования биогенеза OMP — это токсическое накопление развернутых OMP (24, 32, 33). Действительно, когда мы одновременно принимаем MRL-494 и батимастат, мы видим накопление развернутого LamB, которое намного больше, чем то, которое наблюдается с одним батимастатом (рис. 1 G , см. Дорожки, отмеченные «WT»). Эти данные, взятые в целом, показывают, что MRL-494 действует путем ингибирования биогенеза OMP.

BamA

^E470K Придает устойчивость к MRL-494 путем восстановления биогенеза OMP.

Комплекс BAM состоит из одного существенного β-ствола OMP (BamA), 1 незаменимого липопротеина (BamD) и 3 несущественных липопротеинов (BamBCE), которые связываются с одинаковой стехиометрией (8). Поскольку MRL-494 не является субстратом для оттока и нацелен на биогенез OMP, мы предположили, что MRL-494 непосредственно нацелен на BamA, единственный компонент пути биогенеза OMP, который является одновременно важным и доступным на поверхности (28, 30). Поэтому мы создали объединенную библиотеку мутагенеза ПЦР для bamA и проверили клоны, которые проявляли повышенную устойчивость к MRL-494 по сравнению со штаммом, несущим bamA дикого типа в жидкой культуре ( SI Приложение , рис.S2). Мы выделили один устойчивый клон, кодирующий BamA ^E470K (рис. 2 A ). BamA ^E470K был достаточным для роста гаплоидов при хромосомном кодировании ( SI Приложение , фиг. S3) и обеспечивал устойчивость к MRL-494 до предела растворимости MRL-494 (фиг. 2 B ). В ходе дальнейшего исследования мы обнаружили, что на фоне Δ bamB , который значительно снижает МИК MRL-494 (рис.1 D ), BamA ^E470K обеспечивает 32-кратную устойчивость к MRL-494 (рис.2 С ). Было обнаружено, что скорость спонтанного сопротивления на фоне Δ bamB составляет менее 3,5 × 10 ^-10 при использовании от 1 до 3 значений MIC MRL-494.

Рис. 2.

BamA ^E470K обеспечивает устойчивость к MRL-494 и восстанавливает биогенез OMP. ( A ) Структура домена β-бочки BamA (59) показана на виде сбоку (из плоскости OM) и виде сверху (снаружи OM). E470 обозначен красными полосками, а внеклеточная петля 6 обозначена синим цветом.( B ) Экспрессия bamA _E470K приводит к повышенной устойчивости к MRL-494. Штаммы с истощением BamA, несущие указанные плазмиды, выращивали без арабинозы для истощения BamA из хромосомной копии bamA , а затем анализировали устойчивость к MRL-494 с помощью процедуры MIC. Показан OD600 после ночной обработки MRL-494. Данные представляют 3 биологических повтора. ( C ) Экспрессия bamA _E470K приводит к значительному увеличению устойчивости к MRL-494 на фоне Δ bamB .Δ bamA Δ bamB либо с bamA дикого типа, либо с bamA _E470K на сайте присоединения Tn7 анализировали на устойчивость к MRL-494 с помощью процедуры MIC. Показан OD600 после ночной обработки MRL-494. Данные представляют 2 независимых эксперимента. ( D ) Устойчивость к MRL-494 коррелирует с остатком в BamA ^E470 . Клетки, несущие плазмиды с различными аллелями bamA _E470 , обрабатывали, как в случае B , и анализировали на устойчивость к MRL-494.Данные представляют 2 независимых эксперимента. ( E ) Экспрессия bamA в меродиплоиде увеличивает устойчивость к MRL-494. Штаммы, экспрессирующие bamA или bamA _E470K в меродиплоиде или гаплоиде, анализировали на чувствительность к MRL-494 с помощью процедуры MIC. Показан OD600 после ночной обработки MRL-494. Данные представляют 2 независимых эксперимента.

Затем мы задались вопросом, будут ли другие остатки в BamA ^E470 также оказывать сопротивление.Примечательно, что степень сопротивления MRL-494 коррелировала с зарядом остатка на E470 (рис. 2 D ). Таким образом, мутанты BamA ^E470 с более значительными изменениями заряда становятся все более устойчивыми к MRL-494.

Чтобы проверить эффекты bamA _E470K непосредственно на биогенез OMP, мы контролировали сборку модели OMP LamB как в штамме дикого типа, так и в устойчивом штамме в присутствии и в отсутствие MRL-494. Экспрессия bamA _E470K не изменяет сборку LamB в отсутствие MRL-494 (рис.1 G , сравните полосы движения транспортных средств). Однако в присутствии MRL-494 и батимастата сборка тримеров LamB частично восстанавливалась в штаммах, несущих мутацию bamA _E470K , демонстрируя, что BamA ^E470K действует для восстановления сборки OMP в OM в присутствии РСЗО-494. Кроме того, BamA ^E470K предотвращал токсическое накопление развернутых OMP в присутствии MRL-494 и батимастата (фиг. 1 G , сравните дорожки MRL-494 + батимастат).

Два возможных механизма могут объяснить восстановление биогенеза OMP в обработанных MRL-494 штаммах, несущих bamA _E470K : 1) MRL-494 ингибирует функцию BamA, а BamA ^E470K снимает это ингибирование или 2) MRL-494 нацелен на другой компонент пути биогенеза OMP, и bamA _E470K является шунтирующим супрессором, восстанавливающим биогенез OMP, несмотря на ингибирование целевого компонента. Чтобы исследовать эти возможности, мы изменили соотношение BamA к остальной части комплекса BAM, экспрессируя bamA в меродиплоиде.Экспрессия 2 копий bamA дикого типа приводила к 2-кратному увеличению MIC MRL-494 (фиг. 2 E ), вероятно, из-за части связывания MRL-494 с BamA, которая не является частью активный комплекс БАМ. Эти результаты также исключают возможность того, что MRL-494 использует BamA в качестве канала для проникновения в клетку, поскольку при сверхэкспрессии bamA можно ожидать снижения MIC. В меродиплоиде bamA _E470K продемонстрировал неполное доминирование над bamA дикого типа, поскольку полные функциональные комплексы BAM были образованы как с BamA дикого типа, так и с BamA ^E470K (рис.2 E ). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что MRL-494 нацелен на функцию BamA, чтобы ингибировать способность комплекса BAM вставлять OMP в OM.

Чтобы подтвердить этот вывод, мы провели эксперименты по анализу теплового сдвига клеток (CETSA) с MRL-494 (рис. 3) (34, 35). Мы обнаружили, что MRL-494 стабилизировал BamA против термически индуцированной агрегации белков in vivo (рис. 3 A ), что часто является признаком прямого или проксимального взаимодействия с мишенью (36). Мы также измерили термостабильность других членов комплекса BAM (BamB, BamC и BamD) и других β-стволовых белков OMP, таких как OmpA, но не наблюдали термостабилизации этих белков с помощью MRL-494 ( SI Приложение , Инжир.S4). Эти данные не подтверждают биофизическое действие на белки β-ствола, отличные от BamA, или на более широкий эффект MRL-494 на комплекс BAM в целом. Впоследствии мы определили, что мутант BamA ^E470K также был термостабилизирован обработкой MRL-494 (фиг. 3 B ). Этот результат повышает вероятность того, что мутант BamA ^E470K индуцирует устойчивость к MRL-494 посредством механизма, отличного от блокирования прямого связывания белка / соединения.

Рис. 3.

MRL-494 связывается прямо или проксимально с BamA.CETSA измеряет изменения термостабильности белков в ответ на соединения в клеточном контексте. Прямое или проксимальное связывание белка с соединением может повысить термостабильность белка. ( A ) Двумерное масс-спектрометрическое измерение CETSA BamA в присутствии указанных концентраций MRL-494. MRL-494 стабилизирует BamA при повышенных температурах, но не влияет на содержание BamA при 37 ° C. Красный цвет указывает на логарифмическое изменение в ₂ раз в 1,2, голубой указывает на логарифмическое изменение в ₂ раз, равное 0, а темно-синий указывает на логарифмическое изменение в ₂ раз в -0.2. Данные представляют 2 независимых эксперимента. ( B ) bamA ⁺ и bamA _{Клетки E470K} инкубировали с указанными концентрациями MRL-494. Изотермический «отпечаток» доза-реакция был измерен в диапазоне температур. Дозозависимая стабилизация наблюдалась в клетках bamA ⁺ и bamA _E470K . Данные являются репрезентативными для двух биологических повторов.

BamA

^E470K Сохраняет возможность сборки OMP.

Поскольку мутация E470K не изменяет связывание MRL-494 с BamA, мы охарактеризовали аллель bamA _E470K в отсутствие MRL-494, чтобы определить, влияет ли мутация на функцию BamA. Клетки, экспрессирующие bamA _E470K , демонстрировали характер роста, аналогичный изогенным контрольным клеткам ( SI Приложение , рис. S5 A ), что указывает на то, что bamA _E470K не вызывает дефект роста или изменить переход между разными фазами роста.Затем мы проверили прочность барьера проницаемости ОМ и обнаружили, что меродиплоидные или гаплоидные клетки для bamA _E470K не были более чувствительны к антибиотикам, чем клетки дикого типа: штамм bamA _E470K имеет интактный штамм. Барьер проницаемости ОВ ( SI Приложение , рис. S5 B ).

Мы предположили, что BamA ^E470K может активировать стрессовую реакцию σ ^E и сдвигать профиль экспрессии клетки, чтобы уменьшить нагрузку на ингибированный комплекс BAM.Мы сравнили активацию σ ^E в необработанных клетках, несущих bamA или bamA _E470K , и обнаружили, что BamA ^E470K не повышает передачу сигналов σ ^E (приложение SI C , рис. ). Кроме того, устойчивые клетки не показали изменений в уровнях OMP ( SI Приложение , Рис. S5 D ), а bamA _E470K не имеет синтетических эффектов с мутантами биогенеза OMP ( SI Приложение , Рис.S5 E и F ), хотя мы действительно наблюдали частичное подавление чувствительности к антибиотикам штамма Δ surA ( SI Приложение , рис. S5 F ). Таким образом, функция BamA ^E470K по существу неотличима от белка дикого типа.

BamA

^E470K Дестабилизирует домен β-цилиндра.

Мутация bamA _E470K изменяет аминокислоту в середине четвертой β-цепи, и пораженная боковая цепь указывает на просвет β-цилиндра (рис.2 А ). Чтобы определить, повлияла ли эта мутация на стабильность β-ствола BamA, мы использовали свойство теплового изменения. β-бочкообразные белки настолько стабильны, что они остаются свернутыми во время гель-электрофореза с додецилсульфатом натрия (SDS), если образцы не нагреваются (37). Таким образом, стабильность β-цилиндра может быть проанализирована посредством различной миграции свернутых и развернутых белков с помощью гель-электрофореза.

Мы проанализировали термомодифицируемость BamA ^E470K и других изменений остатков BamA ^E470 , чтобы исследовать различия в конформационной гибкости белков (рис.4 А ). Замена различных аминокислот в остатке E470 влияла на стабильность β-цилиндра BamA, на что указывало изменение миграции неденатурированных образцов. Интересно, что стабильность была изменена таким образом, который коррелировал с зарядом аминокислотной замены. BamA ^E470K и BamA ^E470R , самые крайние замены, вызвали наибольший сдвиг в модифицируемости тепла; большая часть белка была развернута перед термообработкой. BamA ^E470A и BamA ^E470G , наименее заряженные замены, не изменяли стабильность β-цилиндра по сравнению с BamA дикого типа.Примечательно, что изменения стабильности хорошо коррелировали со степенью устойчивости к MRL-494 (сравните фиг. 4 A и фиг. 2 D ). Однако стабильности β-ствола недостаточно для устойчивости к MRL-494, поскольку bamA _G655D , ранее охарактеризованная мутация, которая снижает стабильность ствола (38), не вызвала устойчивости к MRL-494 ( SI Приложение ). , Рис. S6 A ). Таким образом, хотя BamA ^E470K сохраняет функцию дикого типа, он действительно имеет измененную конформацию.

Рис. 4.

Изменения заряда BamA E470 увеличивают активность BamA. ( A ) Остатки BamA ^E470 влияют на конформационную стабильность BamA. Истощающий BamA штамм, несущий кодируемую плазмидой аллели bamA _E470 , выращивали до midlog в отсутствие арабинозы. Вареные (денатурированные) и сложенные образцы анализировали гель-электрофорезом. ( B ) BamA ^{E373K / E470K} жизнеспособен в гаплоиде. Истощающий BamA штамм, несущий указанные плазмиды, серийно разводили только на среде LB или LB, содержащей арабинозу или фукозу, для отслеживания зависимости от хромосомно-кодируемого bamA. ( C ) Подавление аллеля bamA _E373K коррелирует с зарядом bamA _E470 . Указанные штаммы анализировали на гаплоидную жизнеспособность, как описано в B .

Генетические взаимодействия

bamA _E470K .

Хорошо известно, что BamA и BamD существуют в нескольких состояниях и что сборка OMP требует, чтобы эти конформации были должным образом скоординированы.Правильное взаимодействие между субкомплексами BamCDE и BamAB необходимо для активации каждого из них для сворачивания и вставки OMP в ОМ (39, 40). Мутации, которые изменяют конформацию BamA или BamD, могут мешать этой координации и предотвращать сборку OMP (41). Супрессорные мутации в bamA или bamD обходят необходимость в этой координации и восстанавливают сборку OMP (40, 41). Поскольку мутация bamA _E470K позволяет сохранить функцию, несмотря на присутствие MRL-494 (рис.2 B ), мы проверили, как этот мутант повлияет на генетические взаимодействия с нашей коллекцией мутаций bam .

Мутация bamA _E373K нарушает взаимодействие между BamA и BamD и является летальной для гаплоидов из-за отсутствия надлежащей координации между двумя белками (41). Этот летальный фенотип может подавляться как внутригенными супрессорами в bamA ( bamA _K351E ), так и с экстрагенными супрессорами в bamD ( bamD _{R197L без надлежащей координации, необходимой для восстановления ). правильное взаимодействие между двумя белками (40, 41).При нашей генетической характеристике bamA E470K мы обнаружили, что эта мутация является внутригенным супрессором bamA E373K : штамм, несущий bamA}

10703K4 viable , хотя и болеет (рис. 4 B ). Это демонстрирует, что, хотя BamA ^E470K полностью способен к сборке OMP, мутантный белок обходит контрольные точки, обычно требуемые для сборки.

Поскольку измененная конформация и степень устойчивости к MRL-494 коррелируют с аминокислотной заменой в кодоне 470, мы проверили, коррелирует ли также внутригенное подавление мутации bamA _E373K . Поразительно, что bamA _{E373K / E470A} не было жизнеспособным в гаплоиде, в то время как bamA _{E373K / E470R} был (рис. Сопротивление , и MRL-494.Рост bamA _{E373K / E470R} оказался более устойчивым, чем рост bamA _{E373K / E470K} , что позволяет предположить, что замещение глутамата на аргинин является более сильным супрессором. Однако ни внутригенный супрессор bamA _E373K , ни bamA _K351E , ни экстрагенный супрессор bamA _{E373K 9010am -494 ( СИ приложение , рис.S6 C и D ). Отсутствие устойчивости в клетках, экспрессирующих аллель усиления функции bamD R197L , снижает вероятность того, что BamD является потенциальной мишенью для MRL-494. Таким образом, хотя BamA ^E470K не имеет измененной функции в сборке OMP дикого типа в лабораторных условиях, он имеет измененную конформацию и активность. Оба они коррелируют с устойчивостью к MRL-494. Однако ни конформационное изменение, ни измененная активность не кажутся достаточными для объяснения устойчивости к MRL-494, хотя они могут быть необходимы для устойчивости.}

MRL-494 подавляет грамположительные и -отрицательные микробы посредством различных механизмов действия.

Во время первоначального скрининга мы обнаружили, что MRL-494 подавляет рост грамположительных бактерий в дополнение к грамотрицательным бактериям ( SI Приложение , Таблица S1). Поскольку грамположительные виды не имеют ОМ, мы предположили, что MRL-494 должен иметь второй механизм действия, который убивает грамположительные бактерии. Чтобы исследовать эту модель, мы сравнили гибель клеток E.coli и Bacillus subtilis после обработки MRL-494. E. coli выживает в течение нескольких поколений после обработки до уменьшения количества клеток (фиг. 5 A ). Однако клеток B. subtilis погибли сразу после обработки MRL-494 (фиг. 5 B ), демонстрируя кинетику гибели, отличную от кинетики, наблюдаемой у E. coli .

Рис. 5.

MRL-494 разрушает цитоплазматическую мембрану B. subtilis , но не E.coli . ( A — C ) MRL-494 убивает грамположительные клетки аналогично низину. Указанные виды выращивали до средней длины. OD600 контролировали после обработки ДМСО или 1 × MIC низина или MRL-494. ( D и E ) MRL-494 и низин повышают проницаемость клеток B. subtilis ( D ), но не клеток E. coli ( E ). Клетки обрабатывали указанным антибиотиком и окрашивали йодидом TO-PRO-3. Проницаемость контролировали с помощью проточной цитометрии.Данные представляют 2 независимых эксперимента.

Учитывая катионную, амфифильную и пептидную структуру MRL-494, мы стремились понять, может ли он имитировать разрушающую мембрану активность антимикробных пептидов. Таким образом, мы проверили, была ли наблюдаемая нами кинетика смерти сходной с кинетикой разрушающего мембраны антимикробного пептида низина. Внезапная гибель клеток B. subtilis оказалась поразительно похожей на быстрое снижение количества клеток, наблюдаемое после воздействия антимикробного пептида низина (сравните рис.5 B и C ) (42). Эти данные предполагают, что MRL-494 может убить B. subtilis аналогично низину.

Низин представляет собой порообразующий бактериоцин класса I, который подавляет грамположительные бактерии путем связывания с липидом II, предшественником биосинтеза пептидогликана, ассоциированным с цитоплазматической мембраной. Затем низин внедряется в цитоплазматическую мембрану, образует поры и проницаемость мембраны (42, 43). Чтобы проверить, разрушает ли MRL-494 аналогичным образом грамположительную цитоплазматическую мембрану, мы обрабатывали клетки и контролировали целостность мембраны при концентрации сублетального соединения, используя краситель, который определяет проницаемость мембраны, иодид TO-PRO-3 (44).Йодид TO-PRO-3 непроницаем для мембран, но способен проникать в клетки, поврежденные мембраной, и связывается с двухцепочечной ДНК (44). Экспоненциально растущие клетки E. coli и B. subtilis окрашивали йодидом TO-PRO-3 и обрабатывали диметилсульфоксидом (DMSO), MRL-494 или низином. Клетки E. coli не показали флуоресцентного сдвига после воздействия низина и только минимальную проницаемость под действием MRL-494 (фиг. 5 D и SI, приложение , таблица S2). Напротив, B.subtilis продемонстрировал крайнюю проницаемость после обработки как низином, так и MRL-494, что указывает на то, что MRL-494 проникает через грамположительную цитоплазматическую мембрану (фиг. 5 E и SI Приложение , таблица S2).

Хотя MRL-494 улучшает проницаемость цитоплазматической мембраны грамположительных бактерий, он не проникает через цитоплазматическую мембрану грамотрицательных бактерий, что позволяет предположить, что соединение физически не может достичь этой мембраны из-за присутствия ОМ.Подобное предотвращение активности в отношении грамотрицательных бактерий наблюдается с низином (рис. 5 D ), где предотвращается пермеабилизация, если только ОМ не сильно нарушено (45). Мы попытались изменить ОМ путем увеличения фосфолипидов во внешней створке ОМ ( mlaA * Δ pldA ; ссылка 46) и путем экспрессии мутанта OmpC с открытыми порами (47), чтобы позволить MRL-494 контактировать с цитоплазматическая мембрана грамотрицательных бактерий. Однако эти попытки не увенчались успехом ( SI Приложение , рис.S7).

Обсуждение

В этой работе мы охарактеризуем небольшую молекулу, которая ингибирует сборку OMP у грамотрицательных бактерий. MRL-494 демонстрирует отличительные характеристики ингибитора биогенеза OMP, а именно снижение стационарных уровней OMP вместе с увеличением развернутой формы этих белков, увеличение активации σ ^E и синергизм с мутациями биогенеза OMP. . Мы идентифицируем BamA как мишень для MRL-494 с выделением устойчивого мутанта, bamA _E470K , который сохраняет функцию дикого типа, но имеет измененную активность и конформацию.

Кроме того, мы устанавливаем второй механизм действия MRL-494 против грамположительных бактерий. Структура MRL-494 как катионного амфифила предполагает, что это соединение может разрушать бислои мембраны. Действительно, наша работа показывает, что MRL-494 быстро убивает грамположительные микробы аналогично антимикробному пептиду низину, который, как известно, образует поры в цитоплазматической мембране (42). Мы пришли к выводу, что цитоплазматическая мембрана является мишенью для MRL-494 в грамположительных клетках.

Поразительно, но MRL-494 не проникает через цитоплазматическую мембрану E. coli. Мы предполагаем, что молекула не может проникнуть в ОМ, предотвращая гибель грамотрицательных клеток из-за разрушения внутренней мембраны. Это также объясняет, почему MRL-494 действует независимо от tolC ; барьер проницаемости OM предотвращает попадание соединения в клеточный компартмент, который подвергается оттоку. Вместе эти данные предполагают, что MRL-494 действует на клеточной поверхности, ингибируя биогенез OMP.Хотя известно, что моноклональные антитела ингибируют функцию BamA путем связывания эпитопа, экспонированного на поверхности (38), MRL-494 отличается от небольшой молекулы, которая нацелена на фрагмент, экспонируемый на поверхности.

Наше исследование также показывает, что MRL-494 связывается прямо или проксимально с BamA. Используя CETSA, мы обнаружили, что добавление in vivo MRL-494 стабилизирует термически индуцированную агрегацию BamA дикого типа. Интересно, что MRL-494 также стабилизирует BamA ^E470K , предполагая, что резистентная мутация не изменяет связывание соединения с его мишенью.Таким образом, наши данные показывают, что bamA _E470K является подавителем обхода, который позволяет функционировать BamA, несмотря на присутствие MRL-494. Этот механизм устойчивости к противомикробным препаратам уже наблюдался. Примечательно, что в более ранних исследованиях были охарактеризованы устойчивые к стрептомицину мутанты E. coli , которые продолжают синтез белка, несмотря на сохраняющееся связывание стрептомицина с рибосомой (48, 49). Сходным образом обработанные MRL-494 клетки, экспрессирующие BamA ^E470K , продолжают собирать OMP и поддерживать жизнеспособность клеток.

Мы не определили, где на экспонированной поверхности области связывается BamA MRL-494. Без более подробной информации, подтверждающей результаты, полученные с помощью CETSA, мы не можем исключить возможность того, что MRL-494 разделяется на ОМ и изменяет свойства мембраны таким образом, что отрицательно влияет на функцию BamA без прямого взаимодействия с BamA. Предыдущая работа продемонстрировала критическую важность внеклеточных областей BamA для функции белка (11, 39, 50), а активность BamA была связана с текучестью ОМ (51).Движение внеклеточной петли 6 BamA является важной частью конформационного цикла BamA (39, 50). Кроме того, как отмечалось выше, связывание моноклональных антител с внеклеточной петлей 4 ингибирует функцию BamA (11). Взаимодействие MRL-494 с открытой поверхностью BamA или измененные свойства мембраны, вызванные добавлением лекарства, могут препятствовать функции BamA, нарушая существенные конформационные изменения, которые способствуют сборке OMP. Дальнейшие исследования для характеристики этого конформационного изменения и того, влияет ли MRL-494 прямо или косвенно на BamA, продолжаются.

Активация комплекса BAM включает связь между BamA и BamD, приводя к дополнительным конформационным состояниям, которые позволяют сборке OMP продолжаться (32, 39, 40). Предыдущие исследования выявили активирующие мутации как в BamA, так и в BamD, которые подавляют условия дефекта сборки и обходят требование конформационной координации между этими двумя важными белками (38, 39, 41). Например, мутация bamA _E373K , которая нарушает существенную связь между BamA и BamD (6), может быть подавлена ​​путем активации мутаций в BamA или BamD (40, 41).

В данной работе мы выделили bamA _E470K как мутант, устойчивый к ингибитору комплекса БАМ MRL-494. Интересно, что мы обнаружили, что bamA _E470K действует как внутригенный супрессор bamA _E373K , обеспечивая жизнеспособность гаплоидного двойного мутанта. Подавление bamA _E373K bamA _E470K убедительно свидетельствует о том, что аллель bamA _E470K позволяет обходить конформационную координацию внутри BAM.Более того, стабильность бочкообразного домена BamA ^E470K аналогична термолабильности, наблюдаемой в других мутантных белках BamA с измененной активностью (38, 39). Измененная конформация BamA ^E470K , по-видимому, смещает белок в сторону более компетентного к сборке состояния. Это может позволить продолжить сборку OMP даже в присутствии MRL-494. В настоящее время мы исследуем этот интригующий вопрос.

Распространенность устойчивости к антибиотикам требует выявления новых антибиотиков, которые обходят традиционные механизмы устойчивости.В этой работе мы демонстрируем, что недавно идентифицированная малая молекула MRL-494 ингибирует фундаментальный процесс, модулируя функцию BamA. Кроме того, способность MRL-494 действовать извне клетки преодолевает внутреннюю резистентность грамотрицательных бактерий и активность оттокных насосов MDR, что делает его невосприимчивым ко многим распространенным механизмам резистентности.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы.

Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, перечислены в SI Приложение , Таблица S3.Все штаммы были сконструированы с использованием стандартных методов микробиологии и молекулярной биологии, как описано ранее (52). Все штаммы выращивали при 37 ° C в среде бульона Lysogeny (LB), если не указано иное, с добавлением 50 мг / л канамицина, 20 мг / л хлорамфеникола, 0,2% арабинозы и 0,05% фукозы при необходимости. Делеционные аллели происходят из коллекции Кейо и коллекции Блаттнера (53, 54). Кассеты резистентности, фланкированные FRT, удаляли с использованием системы рекомбиназы Flp, как описано ранее (55).

Конструирование плазмид.

Сайт-направленный мутагенез выполняли на указанных плазмидах с использованием протокола сайт-направленного мутагенеза Q5 (New England Biolabs [NEB]). Клетки Mach-1 (Thermo Fisher Scientific) использовали для клонирования. bam _AE470K и bamA + под контролем нативного промотора bamA были интегрированы в сайт присоединения Tn7 с использованием pGRG25Modular :: bamA , как описано ранее (56, 57).

Случайный мутагенез bamA выполняли с помощью комбинации подверженной ошибкам ПЦР сконструированных доменов и бесшовной сборки Golden Gate в остов плазмиды дикого типа. ПЦР, подверженную ошибкам, выполняли с использованием набора для произвольного мутагенеза GeneMorph II (Agilent). Поскольку скорость мутагенеза способствует размеру гена, мутагенез выполняли для периплазматических доменов Potra (от P1 до P5) и бочкообразных доменов отдельно, чтобы поддерживать общую низкую частоту мутаций (от 1 до 5) на ген. Вкратце, периплазматический и цилиндрический домены амплифицировали с использованием пар праймеров AK-379 / AK-381 и AK-382 / AK-383, соответственно, из плазмиды pBAD18 :: bamA , следуя инструкциям производителя по низкочастотному мутагенезу.Было проведено не менее 10 независимых реакций. Праймеры AK-382 / AK-380 и AK-384 / AK-381 использовали для амплификации остова плазмиды вместе с оставшимся геном bamA из плазмиды pZS21 :: bamA с использованием высокоточной полимеразы Q5 (NEB). Все продукты ПЦР обрабатывали DpnI для удаления матричных плазмид, и сборку Golden Gate проводили с использованием ферментов BsaI (NEB) и ДНК-лигазы T4 (NEB) в соответствии с протоколом производителя. Сборки были преобразованы в E.coli Mach-1 и высевают на селективные чашки, давая примерно 10000 колоний. Правильность сборки и частота мутагенеза были подтверждены секвенированием 20 случайных колоний. Остальные колонии объединяли и изолированную библиотеку плазмид использовали для последующего скрининга.

Измерение минимальной ингибирующей концентрации (МИК).

Были сделаны двукратные серийные разведения MRL-494 в ДМСО, чтобы охватить окончательную обработку при 4-кратном превышении МИК (64 мкг / мл) до 512 раз ниже МИК (0.03125 мкг / мл). Разведения делали в 50 раз выше, чем желаемая концентрация для обработки, чтобы учесть разбавление при обработке. Ночные культуры разбавляли 1:50, а затем дополнительно разбавляли 1: 1000 в свежей среде. 98 мкл разведенных клеток вносили в 96-луночный планшет и добавляли 2 мкл серийных разведений MRL-494. Планшет инкубировали в течение ночи при 37 ° C, и оптическую плотность при 600 нм (OD600) считывали через 16 и 20 часов на ридере для планшетов BioTek Synergy h2.МИК для мутантов биогенеза OMP проводили в среде Müeller Hinton II.

Селекция для мутантов, устойчивых к MRL-494.

JCM320 (BamA-истощающий штамм) трансформировали пулами плазмид библиотеки мутагенеза bamA и выращивали в отсутствие арабинозы для истощения хромосомного BamA дикого типа. Клетки, трансформированные плазмидой pZS21, содержащей bamA дикого типа, служили контролем. Эти мутанты bamA подвергали скринингу против MRL-494 с использованием анализов MIC, описанных выше, с разведениями от 4-кратного более высокого, чем MIC, до 32-кратного более низкого, чем MIC.Из этих скринингов мы собрали клетки, растущие выше MIC, и идентифицировали плазмидную копию bamA путем секвенирования.

Эффективность анализа посева.

Ночные культуры нормализовали по OD600 и серийно разводили в LB. Клетки наносили на указанные среды и выращивали в течение ночи при 37 ° C.

Кривые роста и σ

^E Reporter Assay.

Кривые роста и анализы репортеров выполняли, как описано ранее (24), с небольшими модификациями.Вкратце, ночные культуры указанных штаммов разводили 1: 100 в среде LB, содержащей хлорамфеникол, для поддержания плазмиды там, где это необходимо. Клетки выращивали при встряхивании в 96-луночном планшете в течение 1,5 ч при 37 ° C в планшет-ридере BioTek Synergy h2. Затем добавляли ДМСО или MRL-494 с батимастатом и без него (1,56 мкМ, 0,25 × МИК) в разведении 1:50 до конечного объема 100 мкл / лунку. Затем клетки возвращали в планшет-ридер на указанное время. Для кривых роста без обработки соединением клетки выращивали в течение 12 ч без прерывания встряхивания в 24-луночном планшете объемом 2 мл.Для всех анализов рост определяли на основании измерений OD600. Для анализа репортера σE штаммы, несущие репортерную плазмиду pACYC184-PmicA :: GFP (24), выращивали в черном 96-луночном планшете с прозрачным дном и обрабатывали, как указано выше. Флуоресценцию (возбуждение, 481 нм / испускание, 507 нм) измеряли и нормализовали до OD600. Затем для экспериментов по лечению соединения рассчитывали значения кратности для необработанных образцов. В некоторых случаях кривые роста, анализ σE-репортера и иммуноблоты выполнялись на одних и тех же образцах.

Подготовка образцов для иммуноблот-анализа.

Образцы были подготовлены для иммуноблот-анализа, как описано ранее, с небольшими изменениями (24). Для образцов после обработки соединением образцы готовили, как для кривых роста, и инкубировали через 1,5 часа после обработки соединением. Образцы ресуспендировали в эквиваленте 1 мл при OD600, равном 1, в 25 мкл Bugbuster (Millipore) с бензоназой (1: 100, Sigma-Aldrich) и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Образцы объединяли с 25 мкл буфера для образцов Laemelli (Bio-Rad) с добавлением 4% -меркаптоэтанола.Для определения общего уровня OMP образцы кипятили в течение 10 мин. Для анализа складчатости LamB образцы готовили, как указано выше, но не кипятили. Для анализа содержания OMP без обработки MRL-494 клетки собирали из стационарной фазы и ресуспендировали в буфере для образцов белка в количестве, эквивалентном 1 мл при OD600, равном 1, в 50 мкл буфера для образцов.

Иммуноблот-анализ.

Иммуноблот-анализ выполняли, как описано ранее, с небольшими изменениями (28). Вкратце, образцы загружали в гели для электрофореза (PAGE) 10% SDS / полиакриламидного геля и проводили при 120 В.Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, и мембраны блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке в течение 2 ч при 4 ° C. Мембраны инкубировали с первичным антителом в трис (гидроксиметил) аминометановом (Трис) солевом растворе Tween 20 в течение ночи при 4 ° C (αBamA 1: 20 000; αLptD 1: 10 000; αDegP 1: 30 000; αGroEL 1: 10 000 [Sigma-Aldrich] ; αOmpF [OmpC] 1: 30 000; αLamB [OmpA, MBP] 1: 5 000). Мембраны промывали и инкубировали с вторичным антителом ослиного α-кролика к HRP (Sigma-Aldrich) (1: 20 000; 1 час при комнатной температуре или 2 часа при 4 ° C).Мембраны промывали и сигнал детектировали с помощью химической люминесценции (Millipore).

Анализ модифицируемости тепла.

Культуры Midlog (OD600, ∼0,8 до 1,0) нормализовали с помощью OD600 и лизировали в смеси Bugbuster (Millipore), смеси ингибиторов протеаз (1: 100; Sigma-Aldrich), бензоназы (1: 100; Sigma-Aldrich). и 1 М MgCl2 (1: 100). Образцы были разделены на две части: один набор инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, а другой кипятили при 100 ° C в течение 10 минут. Образцы разбавляли 1: 2 буфером для образцов Laemelli (Bio-Rad) с добавлением β-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich).Образцы подвергали электрофорезу при 90 В при 4 ° C и проводили иммуноблот-анализ, как описано выше.

TO-PRO-3 Окрашивание и проточно-цитометрический анализ.

Образцы Midlog (OD600 ∼ 0,6), выращенные в среде Müeller Hinton II (MHII) при 37 ° C, разбавляли до ∼1 × 10 ⁶ клеток в 1 мл фильтрованной среды MHII. Клетки обрабатывали ДМСО, низином (до конечной концентрации 5 мкМ) или MRL-494 (конечная концентрация 4 мкг / мл, 0,25 × МИК) в течение 5 минут при комнатной температуре. Иодид TO-PRO-3 (Thermo Fisher Scientific) добавляли до конечной концентрации 500 нМ и инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 5-10 мин.Образцы обрабатывали на проточном цитометре BD Biosciences LSRII и собирали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva 8.0.2. Было проанализировано не менее 125 000 событий. Иодидный краситель TO-PRO-3 возбуждали на длине волны 640 нм, и излучение регистрировали через полосовой фильтр 670/30. Популяции были привязаны к площади прямого рассеяния по сравнению с площадью бокового рассеяния для исключения обломков, ширины прямого рассеяния по сравнению с высотой прямого рассеяния для исключения агрегатов и, наконец, по площади прямого рассеяния по сравнению с сигналом TO-PRO-3 для оценки проницаемости. .Количественная оценка проточного цитометрического анализа ( SI Приложение , таблица S2) представляет собой среднее значение 2 биологических повторов, и графики проточной цитометрии (рис. 4 D и E ) являются репрезентативными. Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 10.5.3 (FlowJo LLC).

Приготовление образца для анализа клеточного теплового сдвига (CETSA).

Закваску LB инокулировали диким типом или bamA _E470K мутантом E. coli .Его выращивали в течение ночи при 37 ° C при встряхивании (180 об / мин). На следующий день разведение закваски 1:50 вносили в 200 мл LB. Образцы выращивали 2,5 ч при 37 ° C при встряхивании 180 об / мин. Затем культуры переносили в конические пробирки объемом 50 мл и осаждали центрифугированием при 3000 × 90 449 g в течение 20 мин при 4 ° C. Образцы разделяли, обрабатывали 0, 25, 50 или 100 мкМ MRL-494 в ДМСО (конечная концентрация ДМСО 1% [объем / объем]) и инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут с аэрацией; Образцы объемом 80 мкл помещали в пробирки для ПЦР и нагревали до указанной температуры в течение 3 минут в термоциклере Bioer Genetouch с последующей 3-минутной инкубацией при 25 ° C; 40 мкл 1.К образцам добавляли 2% (об. / Об.) IGEPAL CA-630 в фосфатно-солевом буфере, и образцы замораживали и оттаивали 4 раза, чередуя жидкий азот и инкубацию при 25 ° C в термоциклере. Образцы центрифугировали при 20000 × g в течение 20 минут при 4 ° C и собирали 40 мкл супернатанта.

Образцы

объединяли с загрузочным буфером трис-глицина SDS, содержащим дитиотреитол, и анализировали с помощью ПААГ на 10% трис-глициновых гелях с буфером для бега с нативным трис-глицином Novex.Электрофорез проводили при 20 мВ в течение 5 ч при 4 ° C. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, и мембраны блокировали блокирующим буфером LICOR в течение 30 мин. Мембраны зондировали с использованием антитела α-BamA и вторичного антитела козьего α-кролика к HRP. Сигнал обнаруживали с помощью хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific) и системы визуализации Bio-Rad Chemidoc.

CETSA Подготовка проб для масс-спектрометрического анализа.

Образцы CETSA были приготовлены, как описано выше; Собирали 60 мкл супернатанта и объединяли со 100 мкл 50 мМ триэтиламмонийбикарбонатного буфера, pH 8.0 и 16,8 мкл Proteasemax 1% мас. / Об. Гидрохлорид трис (2-карбоксиэтил) фосфина и йодацетамид добавляли до конечной концентрации 10 и 15 мМ соответственно. Образцы инкубировали при 55 ° C в течение 30 мин. После инкубации добавляли CaCl ₂ до конечной концентрации 1 мМ. Образцы обрабатывали 2 мкг трипсина / LysC в течение ночи при комнатной температуре.

После переваривания добавляли трифторуксусную кислоту (TFA) до концентрации 1% об. / Об. И инкубировали в течение 15 мин.Образцы осаждали в количестве 2,000 × г и собирали супернатант. Для обессоливания образцов использовалась система Assaymap Bravo с картриджами для обессоливания C18. Пептиды элюировали 35% ацетонитрила и 65% воды (0,1% TFA). Образцы сушили с помощью speedvac, и пептиды ресуспендировали в 100 мкл 50 мМ TEAB. Пептиды метили реагентами тандемной массы (TMT) 10-plex. Пептиды от каждой обработки смешивали при каждых 2 смежных температурах. Затем смеси пептидов сушили, ресуспендировали в воде, содержащей 0.1% TFA и очищали с использованием центрифуги для удаления детергента Pierce. Очищенные пептиды снова обессоливали. Высушенные очищенные пептиды ресуспендировали в 20 мкл 95% воды, 5% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты.

Масс-спектрометрический анализ.

Образцы вводили в Orbitrap Fusion Lumos (колонка C18 50 см × 75 мкм) и прогоняли в 4-часовом линейном градиенте от 5% ацетонитрила до 40% ацетонитрила. Количественное определение TMT было выполнено с помощью MS3, как описано ранее (58). Спектры были проанализированы против E.База данных coli K12, загруженная из UniProt с использованием Maxquant версии 1.6.3.4 (триптические пептиды без пропущенных расщеплений). Окисление метионина было исключено из количественной оценки, и данные были отфильтрованы для удаления загрязняющих пептидов. Используя Perseus 1.6.0.7, данные были преобразованы в журнал ₂ и введены пропущенные значения. Белки были нормализованы по средней репортерной метке TMT на канал.

Бумага с VCI, летучий ингибитор коррозии

Бумага VCI

Разработанная для защиты от ржавчины и потускнения, в первую очередь черных металлов, бумага с VCI (летучий ингибитор коррозии) поможет в долгосрочной защите стали, чугуна, меди, латуни (с содержанием Zn до 20%), бронзы при транспортировке. и хранение.Просто храните или отправляйте детали, завернутые в бумагу Kite VCI, и они останутся сухими, чистыми и без ржавчины.

Благодаря конструкции этого передового продукта, он защищает, не оставляя жирных или восковых следов, а это означает, что товар можно использовать немедленно, без каких-либо процедур очистки. Эта бумага замедляет процесс коррозии; он не может удалить коррозию, которая уже образовалась перед упаковкой.

Бумага

VCI обычно используется для защиты металлических деталей в машиностроении, двигателей, сверл и крупных металлических изделий, таких как ворота и перила.С бумагой можно обращаться как с обычными бумажными отходами, и она подлежит вторичной переработке. Мы также рекомендуем, если товары хранятся, через два года их переупаковывать, чтобы продлить срок защиты.

Эта бумага обеспечивает упаковку товаров в сухих прохладных помещениях и обеспечивает эффективную защиту для различных металлов. См. Полный список в таблице ниже.

документов VCI | Бумага с летучими ингибиторами коррозии

Protective Packaging предлагает широкий ассортимент бумаги с VCI (летучий ингибитор коррозии) для защиты черных металлов, в том числе стали, чугуна и хрома, от коррозии.В наших бумагах с VCI используется запатентованная нанотехнология с VCI, чтобы ваши грузы, хранящиеся предметы и металлы в процессе обработки были защищены и не подвержены коррозии в течение многих лет. Наша бумага с VCI пропитана с ОБЕИХ сторон специальной формулой VCI, в отличие от односторонних продуктов большинства конкурентов.

Позвоните, чтобы заказать рулоны или листы — 800-644-4032

Документы VCI компании

Protective Packaging:

• Простота использования
• Хорошая прочность на разрыв
• Устойчивость к царапинам и истиранию
• Идеально для рабочего места
• Высокая термостойкость, жесткость
• Быстрая установка защиты VCI
• Соответствует NACE Std TM0208-2008 и RoHS
• Экологически безопасный, полностью перерабатываемый, биоразлагаемый и нетоксичный

Защитная упаковка Бумага с VCI бывает разных сортов.Продукты большего размера или неправильной формы следует защищать с помощью более плотных сортов бумаги, в то время как для небольших деталей можно использовать более легкие базовые веса. Некоторые из наших продуктов с VCI имеют специальные подложки, которые сочетают в себе средство защиты от ржавчины и барьерную упаковку. Бумага и пленки с барьерным покрытием защищают от влаги и жира; ламинированные сорта обеспечивают надежную защиту от окружающей среды и служат средством предотвращения ржавчины.

Бумагу с VCI

Protective Packaging можно преобразовать в листы и обертки для отдельных деталей или в кожухи, крышки и вкладыши для больших кусков или стопок деталей. Звоните для заказа нестандартных листов 800-644-4032 .

Наши бумажные изделия с VCI помогут вашим металлическим деталям оставаться чистыми, сухими и без ржавчины. Будь то отгрузка, хранение или производственные операции, наша сверхпрочная бумага с VCI используется для упаковки металлических деталей, машин и оборудования во многих отраслях, таких как: автомобилестроение, строительство, сельское хозяйство, обработка металлов, электроника, военная промышленность, нефть и газ. , Авиакосмическая промышленность, сталь, серебро, медь, драгоценные металлы и глобальные OEM-компании.Мы также предлагаем пленки с VCI, пакеты с VCI и излучатели с VCI.

Позвоните нам по телефону 1-800-644-4032 или отправьте нам электронное письмо и расскажите о своих потребностях в защите от коррозии.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

.