Перестановка в: Ошибка 404: страница не найдена

как Зеленский провёл кадровые перестановки в украинском оборонном секторе — РТ на русском

Киев ставит на ключевые посты в Министерстве обороны и структурах сектора безопасности «более послушных менеджеров», полагает источник RT в офисе президента Украины. Накануне Владимир Зеленский сменил ряд ключевых фигур в этих ведомствах, объяснив это тем, что руководители всех уровней должны полностью выполнять задачи, необходимые для защиты страны «от вооружённой агрессии». Однако, по мнению экспертов, кадровые изменения мотивированы прежде всего желанием действующего президента наполнить силовые структуры максимально лояльными себе людьми. При этом, как считают аналитики, это вряд ли будет способствовать качественным положительным изменениям в оборонной сфере Украины.

Киев ставит на ключевые посты в Министерстве обороны и структурах сектора безопасности «более послушных менеджеров». С таким утверждением выступил источник RT в офисе президента Украины.

«Киев готовится к новым условиям Соединённых Штатов по Донбассу, ведь Вашингтон может предложить Зеленскому план по завершению боевых действий на востоке страны. А Руслан Хомчак, который до недавнего времени занимал пост главы ВСУ, мог запросто отказаться выполнять указания США, особенно учитывая, что за спиной у него лояльная армия. Зеленский же решил показать себя сильным лидером», — говорит собеседник RT.

Также по теме

«На Украине уже нечего реформировать»: как Зеленский планирует повысить качество армии и оборонного сектора страны

Киев не намерен сокращать расходы на нужды вооружённых сил. Об этом заявил президент Украины Владимир Зеленский. Ранее он неоднократно…

Накануне президент объяснил назначение нового главнокомандующего Вооружёнными силами Украины (ВСУ) и другие кадровые перестановки в секторе безопасности тем, что руководители всех уровней в этой сфере должны полностью выполнять задачи, необходимые для защиты государства «от вооружённой агрессии». Об этом сообщается на сайте украинского лидера.

«Сфера обороны должна функционировать стабильно, скоординированно, с чёткой перспективой и без недоразумений между руководителями», — приводит слова Зеленского его офис.

Глава государства также призвал активизировать работу в Минобороны страны и в ВСУ.

«Если есть необходимость изменить руководящий взгляд на конкретном направлении, это нужно делать», — отметил Зеленский.

Как отметили в его офисе, президент ожидает, что на всех уровнях в вооружённых силах страны, оборонном ведомстве и структурах, отвечающих за безопасность, удастся наладить взаимодействие, что, по его мнению, поможет не допускать ошибок и «позволит повысить эффективность защиты Украины».

• Владимир Зеленский
• Reuters
• © Gleb Garanich/File

«От того, как построены отношения между руководителями, зависит выполнение многих задач — от подготовки государственного оборонного заказа до конкретной работы с нашими военными на передовой, их обеспечения», — заявил Зеленский.

«Попал под горячую руку»

Напомним, ранее президент Украины принял решение об увольнении генерал-полковника Руслана Хомчака с должности главнокомандующего Вооружённых Сил Украины. Вместо него он назначил командира оперативного командования «Север» генерал-майора Валерия Залужного. Хомчак же перейдёт на пост первого заместителя секретаря Совета национальной безопасности и обороны (СНБО) после снятия с этой должности Михаила Коваля.

Как пояснил во время брифинга пресс-секретарь президента Украины Сергей Никифоров, смена главнокомандующего ВСУ связана с конфликтной ситуацией, возникшей между руководством Вооружённых сил Украины и Министерством обороны страны.

«Владимир Зеленский не сомневается в патриотизме, верности присяге, профессионализме Руслана Хомчака, но президент хочет видеть синергию между Министерством обороны и Вооружёнными силами Украины. Такой синергии, к сожалению, мы не видим», — сказал он.

При этом депутат Госдумы РФ от Севастополя Дмитрий Белик объяснил увольнение Хомчака тем, что он попал в немилость Зеленскому, поскольку не обещал «вернуть» Крым до окончания сезона.

Также по теме

«Корень проблем антикоррупционной политики»: как Зеленский пытается урегулировать кризис вокруг директора НАБУ

В команде Владимира Зеленского призвали главу Национального антикоррупционного бюро Украины (НАБУ) Артёма Сытника добровольно уйти в…

«Зеленскому нужны сегодня победы, а их нет, даже по «Северному потоку — 2» без него договорились, а тут ещё и генерал не желает штурмовать полуостров, да ещё и всячески отговаривает от этой пустой затеи. Вот и попал под горячую руку», — пояснил Белик в интервью РИА Новости.

По его словам, новый человек на этом посту, которым, как уже известно, стал Залужный, «развернёт бурную деятельность по «деоккупации Крыма», причём только на словах и бумаге».

Помимо увольнения Хомчака, в украинском Минобороны произошли и другие изменения. Так, Никифоров напомнил, что решением украинского кабмина были уволены сразу три заместителя министра обороны — Александр Миронюк, Игорь Старобинский и Игорь Халимон. По словам пресс-секретаря украинского лидера, назначения на вакантные посты произойдут до конца текущей недели.

«Президент хочет, чтобы современный солдат, который рискует собственной жизнью, имел достойные условия службы, держал в руках современное, надёжное оружие, технику. Именно на этом направлении надо делать больше», — заявил Никифоров.

Также он отметил, что война на Украине «ведётся не только на поле боя, но и в поле информационном» и это направление, как считает президент, надо усилить.

Кроме того, Зеленский снял с должности первого замглавы спецслужбы, а также по совместительству руководителя Антитеррористического центра Руслана Баранецкого и первого замглавы Службы безопасности (СБУ) — начальника Главуправления по борьбе с коррупцией и организованной преступностью Василия Малюка.

• globallookpress.com
• © Str/ZUMAPRESS.com

Комментируя кадровые изменения в СБУ, Сергей Никифоров отметил, что президент и глава Службы безопасности Украины пытаются сейчас привести ведомство к тому виду, который у него должен быть «в день, когда Верховная рада проголосует и поддержит соответствующий законопроект о реформе» службы.

«СБУ хотят лишить несвойственных ей функций, а именно борьбы с экономическими преступлениями», — добавил он.

Ранее Зеленский также уволил главу Службы внешней разведки Валерия Кондратюка и назначил на его место Александра Литвиненко, который занимал пост директора Национального института стратегических исследований. Причины таких перестановок в документах на сайте президента не называются.

«Заменил своими сторонниками»

По мнению экспертов и опрошенных RT источников в политических кругах Украины, кадровые изменения в Минобороны страны и секторе безопасности, которые провели Зеленский и его команда, прежде всего мотивированы желанием украинского президента сделать эти ведомства максимально лояльными по отношению к самому президенту.

В частности, как отметил источник RT в украинских ВС, для Зеленского важно, чтобы его подчинённые были командными игроками, а Руслан Хомчак, уволенный с должности главы ВСУ, не подходил на эту роль, поскольку критиковал президента.

«Хомчак пользуется огромным авторитетом в вооружённых силах, у него большой боевой опыт. Его увольнение негативно отразилось на боевом духе солдат, а новый руководитель пока не внушает доверия. Главная причина для отставки — это конфликт с министром обороны Андреем Тараном, которого поддерживает Зеленский», — рассказал собеседник RT.

По словам заместителя директора Института стратегических исследований и прогнозов РУДН, члена Общественной палаты России Никиты Данюка, президента Украины не устраивало, что Хомчак имел колоссальное влияние на Вооружённые силы Украины, причём некоторые приказы президента не исполнялись или саботировались.

Также по теме

«Сопротивление будет серьёзным»: сможет ли новое управление ГБР Украины расследовать события «майдана»

Государственное бюро расследований (ГБР) Украины создаёт управление по расследованию преступлений, совершённых во время «майдана» в…

«Вполне вероятно, Хомчак, который не проявлял в публичном пространстве каких-либо жестов неуважения, на самом деле потворствовал тому, что на среднем управленческом уровне в Министерстве обороны президента просто не воспринимали. Зеленский же увольнением Хомчака и другими изменениями пытается показать, что украинское государство построено строго по вертикали, что он является президентом, который влияет на происходящее в стране. Кроме того, для него очень важно продемонстрировать силовому блоку, который его не принял и даже отторг, что он не потерпит такого отношения», — пояснил эксперт в беседе с RT.

По мнению Данюка, перед преемником Хомчака украинский лидер поставит задачу восстановить дисциплину в вооружённых силах, в том числе «за счёт зачисток» тех, кто игнорировал поручения президента.

Кроме того, благодаря кадровым изменениям в будущем Зеленский сможет утверждать, что любые реформы, которые принесут положительный эффект, — полностью его заслуга, отметил Данюк.

«В этом смысле украинский лидер не хочет делить лавры с людьми, которые напрямую не ассоциируются с его командой. Поэтому Зеленский провёл своих людей на важные посты в Минобороны и других структурах, получив одобрение от Вашингтона», — пояснил аналитик.

При этом перевод Хомчака на место первого заместителя секретаря СНБО — попытка Зеленского «оставить его в орбите своего влияния», полагает Данюк.

«Находясь на этой позиции, Хомчак больше не сможет напрямую влиять на политические процессы в стране, но будет на виду», — отметил эксперт.

В свою очередь, украинский политолог, директор Института анализа и менеджмента политики Руслан Бортник в интервью RT предположил, что с помощью перестановок в Минобороны и секторе безопасности Зеленский «хочет добиться концентрации власти».

«Из системы силовых органов выбывают люди, которые представляли интересы других политических или финансовых групп либо были связаны с ними. Зеленский не был полностью уверен в их лояльности, поэтому заменил данных лиц своими сторонниками. Кроме того, таким образом украинский лидер хочет показать западным партнёрам, что управляет ситуацией в стране», — сказал эксперт.

Как заявил источник RT в партии «Батькивщина», Зеленский стремится увеличить своё влияние на силовые органы, полагая, что он уже достаточно опытен для этого.

«Но увольнение Хомчака не решит проблемы украинских военных, а новому руководителю ещё нужно найти общий язык со своими подчинёнными», — заявил он.

При этом источник RT в партии «Слуга народа» обратил внимание на то, что у армии Украины нет нормальной техники и наблюдаются проблемы с качеством питания и дисциплиной.

«Вот эти вопросы надо урегулировать, а не внутренние склоки», — отметил он.

• Украинские военнослужащие
• Reuters
• © Valentyn Ogirenko

Как спрогнозировал Никита Данюк, после кадровых перестановок в Минобороны и секторе безопасности продолжатся громкие отставки, могут быть инициированы и коррупционные дела.

«К тому же всё это будет сопровождаться шумной информационной и пиар-кампанией, поскольку Зеленский прекрасно понимает, что уже сейчас ему надо вступать в предвыборную гонку. Ведь его уровень поддержки среди населения как никогда низок. Будет звучать ещё больше заявлений, что украинская армия и структуры, отвечающие за безопасность, идут по пути модернизации. Однако по факту уровень морали и боевого духа оставляет желать лучшего, не говоря уже о технической составляющей украинской армии», — заключил аналитик.

Перестановки в силовых ведомствах — отставки руководителей 2014

Новый глава челябинских следователей отчитал подчиненных

Новый глава следственного управления СКР по Челябинской области Петр Решетников остался недоволен работой подчиненных, не сумевших добиться выплаты долгов по зарплате работникам закрывшихся хлебозаводов в Коркино и Копейске. Об этом он заявил 20 августа корреспонденту URA.RU.

20 августа 2021 13:22

В пермском военном вузе нашли замену скандальному начальнику

Пермский военный институт войск национальной гвардии (Росгвардии) возглавил генерал-майор Евгений Русанов. По данным картотеки «СБИС», Русанов назначен врио начальника с 16 августа 2021 года. Экс-начальник ПВИ Росгвардии Владимир Купавский был отправлен в отставку после возбуждения коррупционного уголовного дела.

17 августа 2021 18:32

В городе Козицына сменился начальник полиции

Новым начальником отдела полиции в Верхней Пышме стал подполковник Артем Талькин, который до этого занимал аналогичную должность в Ирбите. Об этом URA.RU сообщили в пресс-службе ГУ МВД по Свердловской области.

17 августа 2021 11:54

Свердловская прокуратура объявила кастинг после массовых отставок. Инсайд

Прокуратура Свердловской области начала срочно искать новых сотрудников на фоне массовых увольнений по собственному желанию. Ведомству требуются служащие на вакантные должности и в кадровый резерв. Об этом URA.RU сообщили сразу несколько источников в областной прокуратуре.

12 августа 2021 08:54

Колокольцев запустил в уральском главке МВД тотальную проверку. Управление под угрозой ликвидации

В управлении на транспорте МВД по УрФО в Екатеринбурге, где работает комиссия, присланная министром внутренних дел России Владимиром Колокольцевым, инициировано 60 служебных проверок. Тем самым увеличена глубина инспектирования уральского главка, поскольку ранее инсайдер URA.RU в свердловской полиции сообщал о 30 проверках.

10 августа 2021 08:12

В уральском главке МВД массово увольняются начальники. Это вызов генералу

В управлении на транспорте МВД России по УрФО массовое увольнение высокопоставленных сотрудников. Как стало известно URA.RU от информированного источника в ГУ МВД по Свердловской области, в отставку подали три полковника полиции.

06 августа 2021 15:20

Челябинским следователям назначили начальника-свердловчанина

Нового начальника следственного управления СКР по Челябинской области, генерал-лейтенанта юстиции Петра Решетникова 6 августа представили коллективу управления. Эту информацию подтвердили URA.RU в ведомстве.

06 августа 2021 14:29

Челябинскому СКР представят нового руководителя

Коллективу следственного управления СКР по Челябинской области 6 августа представят нового руководителя, генерал-лейтенанта юстиции Петра Решетников. Об этом URA.RU сообщили источник в правоохранительных органах. Ранее Решетников руководил Уральским следственным управлением СКР на транспорте.

06 августа 2021 08:20

Новый зампрокурора Челябинской области приступил к работе. Инсайд URA.RU подтвердился

Новый заместитель прокурора Челябинской области Денис Ситников приступил к работе. Эту информацию URA.RU подтвердили в прокуратуре. В Челябинск Ситников прибыл из Кургана, где он работал в аппарате прокуратуры региона. Приказ о его назначении был подписан в Генпрокуратуре РФ на прошлой неделе, ранее сообщил источник URA.RU.

03 августа 2021 12:41

В управлении МВД на транспорте по УрФО назначены десятки проверок

В Главном управлении на транспорте МВД России по УрФО назначено 30 служебных проверок. Они пройдут в рамках работы комиссии, назначенной главой МВД Владимиром Колокольцевым. Об этом сообщил URA.RU источник в силовых ведомствах.

02 августа 2021 12:45

Колокольцев отправил в Екатеринбург генерала со спецзаданием. Обсуждается ликвидация главка МВД

В Екатеринбурге 28 июля начала работу комиссия, направленная в уральский транспортный главк полиции главой МВД Владимиром Колокольцевым. Руководит делегацией ревизоров главный инспектор министерства генерал-майор Игорь Золотов. Об этом URA.RU сообщил информированный источник в силовых структурах.

29 июля 2021 08:55

Свердловские прокуроры массово увольняются из-за нового шефа. «Так жестко не было никогда»

Массовые увольнения сотрудников прокуратуры Свердловской области связаны с жестким стилем управления главы ведомства Бориса Крылова. Как сообщили URA.RU сразу несколько источников в облпрокуратуре, новый руководитель установил непривычно суровые для работников порядки, из-за чего те по своему желанию уходят со службы.

28 июля 2021 20:54

В полиции Челябинска состоялось новое назначение

Начальником отдела полиции «Северо-Западный» в Челябинске назначен капитан полиции Ерген Нукаев, ранее занимавший должность заместителя начальника ОП «Ленинский» по оперативной работе. Нукаева представил коллективу врио начальника УМВД Андрей Меньшенин. Об этом URA.RU сообщили в пресс-службе ГУ МВД по региону.

26 июля 2021 16:33

Россия безвозмездно поможет Таджикистану в войне с Афганистаном

МИД принял решение оказывать помощь в укреплении обороноспособности Таджикистана. На таджикско-афганской границе Россия безвозмездно построит заставу. Готовится межправительственное соглашение, заявил замглавы МИД Андрей Руденко.

22 июля 2021 12:37

Из свердловской прокуратуры увольняются полторы сотни человек. Инсайд

Больше 160 сотрудников прокуратуры Свердловской области подали рапорты об увольнении по собственному желанию. Сейчас заявления ждут подписи руководителя ведомства Бориса Крылова. Об этом URA.RU рассказали два источника в областной прокуратуре.

21 июля 2021 20:54

В Москве задержан заместитель главы ставропольской ГИБДД

Подполковник полиции и заместитель начальника УГИБДД по Ставропольскому краю Александр Ткаченко задержан вчера в Москве в рамках дела «ОПС Сафонова». Об этом сообщает депутат Александр Хинштейн в своем telegram-канале.

21 июля 2021 15:14

В Челябинске ждут нового генерала СКР

Новый начальник следственного управления СКР по Челябинской области прибудет в Челябинск до конца июля или в начале августа, сообщили источники в силовых структурах. Ведомство возглавит, как уже сообщало URA.RU, генерал-лейтенант юстиции Петр Решетников, ранее руководивший Уральским следственным управлением СКР на транспорте в Екатеринбурге.

21 июля 2021 13:00

Бастрыкин ликвидировал следственный главк в Екатеринбурге. Фамилии генералов пропали с сайта

В России произошло объединение следственных управлений на транспорте. В результате ликвидирован уральский транспортный главк с руководством в Екатеринбурге. Об этом URA.RU официально сообщили в пресс-службе ликвидированного подразделения, подтвердив тем самым инсайд агентства.

21 июля 2021 11:30

В челябинском ГУФСИН ждут генерала из Архангельска. Инсайд

Новым руководителем Главного управления ФСИН (ГУФСИН) России по Челябинской области может стать начальник управления ФСИН по Архангельской области генерал-майор внутренней службы Алан Купеев. Об этом URA.RU сообщил источник в силовых структурах.

20 июля 2021 08:40

Бастрыкин прислал в Екатеринбург сменщика уральского генерала СКР

В Екатеринбург по поручению председателя СКР Александра Бастрыкина со служебной командировкой прибыл начальник Приволжского следственного управления на транспорте СКР Анатолий Митин. Полковник юстиции провел совещание с сотрудниками аналогичного управления в Уральском округе и дал установки по совместной работе. Она начнется после слияния этих двух структур в рамках реформы транспортных следственных главков, говорит источник URA.RU в правоохранительных органах.

15 июля 2021 21:15

Мельниченко озвучил кадровые перестановки в правительстве Пензенской области

Региональное информационное агентство Пензенской области, пожалуй, — единственный источник новостей, где публикуются заметки, охватывающие не только Пензу, но и районы. Таким образом, мы представляем полную картину региона.

На сайте РИА ПО публикуются не только новости Пензенской области, но и аналитические статьи, интервью на актуальные темы, обзоры и фоторепортажи.

Ежедневно по будням мы предлагаем читателям дайджест событий, произошедших в Сурском крае за минувший день.

Новостная лента Пензенской области раскрывает жизнь региона в сфере экономики, общества, спорта, культуры, образования, сельского хозяйства, ЖКХ, здравоохранения и медицины. Помимо этого, на наших страницах публикуется информация о предстоящих событиях, концертах и спортивных мероприятиях.

Вместе с тем, РИА Пензенской области размещает новости инвестиционной политики региона, происшествий, криминала, аварий и ДТП.

Ежедневно в режиме онлайн РИА ПО публикует оперативные и последние новости Пензы и районов Пензенской области. Читатели могут узнать об актуальных событиях Пензенского, Башмаковского, Бековского, Бессоновского, Вадинского, Земетчинского, Спасского, Иссинского, Городищенского, Никольскиого, Каменского, Кузнецкого, Нижнеломовского, Наровчатского, Лопатинского, Шемышейского, Камешкирского, Тамалинского, Пачелмского, Белинского, Мокшанского, Неверкинского, Сердобского, Лунинского, Малосердобинского, Колышлейского и Сосновоборского районов.

Новости Пензы и Пензенской области — здесь собраны последние и самые важные публикации о том, что сегодня происходит в городе: культурные, спортивные события, актуальные нововведения в сфере ЖКХ и строительства, происшествия, чрезвычайные ситуации, ДТП, аварии, криминальная хроника.

Мы также не оставляем без внимания достижения земляков: спортсменов, представителей культуры, науки и образования.

На страницах РИА Пензенской области оперативно публикуются не только фотографии с прошедших мероприятий, но и видео, а также инфографика.

Помимо этого, читателям периодически предлагаются тесты на знание Сурского края.

Новости Пензы и Пензенской области сегодня — это около ста ежедневных публикаций о том, что в данный момент актуально для жителей областного центра и региона.

На страницах РИА ПО ежемесячно публикуются материалы о вступающих в силу законах, которые коснутся жителей нашего региона.

Наше информационное агентство предоставляет читателям актуальный прогноз погоды в Пензе и Пензенской области на неделю и каждый день с указанием температуры воздуха, направления ветра и осадков. Прогноз сопровождается комментарием специалиста из регионального ЦГМС.

Riapo.ru – это новости Пензы, главные события, факты и мнения об актуальных и насущных вопросах и проблемах в регионе.

Кадровые перестановки в «МегаФоне» | ComNews

© ComNews
20.10.2004

В структуре центрального офиса оператора сотовой связи «МегаФон» произошли изменения – введена должность первого заместителя гендиректора.

На эту позицию назначен заместитель гендиректора «МегаФон» по технике и развитию Алексей Ничипоренко. Теперь Алексей Ничипоренко будет курировать операционный блок компании — техническое, коммерческое и IT подразделения.

Исполняющей обязанности заместителя гендиректора «МегаФона» по коммерческим вопросам назначена Лариса Ткачук, ранее руководившая департаментом маркетинга и продаж компании. На этом посту она сменила покинувшего компанию Руслана Филатова, перешедшего на другую работу.

Структурная коррекция, предпринятая в компании, направлена на усиление операционной части бизнеса «МегаФона». «Мы рассчитываем на то, что это решение повысит управляемость компании и выведет координацию между структурными подразделениями центрального офиса «МегаФона», а также взаимодействие центра и региональных компаний, на качественно новый уровень в соответствии с требованиями времени и тенденциями мирового рынка телекоммуникационных услуг»,- заявил гендиректор «МегаФона» Сергей Солдатенков,

Досье ComNews.ru:

Ничипоренко Алексей Николаевич родился 14 февраля 1966 г. в Ленинграде. В 1988 г. окончил Ленинградское высшее инженерное морское училище им. адмирала С. О. Макарова по специальности «Инженер». В 1998–1999 гг. прошел обучение в Санкт–Петербургском международном институте менеджмента (ИМИСП) по программе «Менеджер».
В 1988–1992 гг. работал инженером в ЦНИИ Морского флота. Затем был ведущим специалистом СП «Морские автоматизированные системы». В 1994 г. пришел в ЗАО «Северо-Западный GSM», где последовательно занимал должности специалиста группы технической эксплуатации, начальника сектора BTS технического отдела, заместителя технического директора, директора по развитию. С октября 2000 г. – директор дивизиона регионального развития ОАО «Телекоминвест». В октябре 2001 г. назначен генеральным директором ЗАО «Соник Дуо». С 2002 года – Заместитель Генерального директора ОАО «МегаФон» по технике и развитию.

Ткачук Лариса Сергеевна родилась 21 ноября 1976 в г. Киеве. В 1998 году окончила Национальный Технический Университет Украины по специальности «промышленный маркетинг». После окончания университета работала руководителем группы бизнес анализа в компании «Украинская Мобильная Связь» (UMC), в 2001 г. переведена на должность начальника отдела маркетинга. С мая 2001 г. – маркетинг менеджер компании RTDC (российско-американский телекоммуникационный холдинг). С октября 2002 г. – начальник департамента маркетинга и продаж ОАО «МегаФон».

Перестановки в правительстве: новые министры и вице-премьер

В правительстве России во вторник, 10 ноября, появились пять новых министров и один вице-премьер. Указы об их назначениях подписал Владимир Путин. Перед этим кандидатуры, выдвинутые премьером, впервые в истории утвердили депутаты Госдумы, как это предполагают принятые летом поправки в Конституцию. Обсуждение в нижней палате длилось несколько часов, и возможностью высказать свое мнение воспользовались все фракции.

Это первые перестановки в правительстве Михаила Мишустина — пять министров и один вице-премьер. Но вначале нужно получить одобрение Госдумы. Впервые в истории российского парламентаризма изменения в кабинете министров нужно согласовывать с депутатами. Обсуждение получилось бурным, неоднозначным и продлилось в полтора раза дольше запланированных двух часов.

Справедливая Россия и ЛДПР были не согласны с двумя кандидатурами. Вот что заявил руководитель фракции ЛДПР Владимир Жириновский:

— Не будем голосовать за министра транспорта. Человек хороший, направление плохое!

Первый заместитель руководителя фракции «Справедливая Россия» Михаил Емельянов сказал следующее:

— У нас вызывает сомнения кандидатура Козлова на должность министра природных ресурсов. Нам не совсем понятно, какое отношение Козлов имеет по своей биографии и прежней деятельности к природным ресурсам и к экологии.

Виталий Савельев за десять лет работы генеральным директором «Аэрофлота» сумел в шесть раз увеличить пассажиропоток (до 60 миллионов человек в год) и больше чем вдвое нарастить авиапарк. Он уверен, что с депутатским корпусом найдет взаимопонимание.

Новый глава Минэнерго — уже бывший генеральный директор «РусГидро» Николай Шульгинов. Всю жизнь он отдал энергетике, но назначение министром для него неожиданность. Шульгинов меняет Александра Новака, который 10 ноября стал десятым вице-премьером. Он получил широкую поддержку в Госдуме — безусловный фаворит депутатского корпуса.

«Первое, что мы начнем с новым утвержденным министром энергетики Николаем Шульгиновым, сядем и обсудим, что нужно сделать в ближайшее время и в среднесрочной перспективе для того, чтобы возобновить работу, выполнить наказы наших избирателей и депутатов», — заявил теперь уже заместитель председателя правительства России Александр Новак.

Новый министр строительства Ирек Файзуллин — человек с огромным опытом. Он возводил в Татарстане объекты к чемпионату мира и универсиаде. Теперь ему предстоит решать задачи в масштабах всей страны.

— Один миллиард квадратных метров, которые нам нужно построить до тридцатого года, это очень серьезная задача. Она требует консолидации и синхронизации всех национальных проектов.

А вот коммунисты, несмотря на то, что претензий к новым министрам не имеют, от голосования по всем кандидатурам воздержались.

— Геннадий Андреевич (Зюганов), почему вы решили воздержаться от голосования?

— В кадровом отношении они, мне думается, укрепляют правительство. Но нужен новый курс, поэтому я еще раз вчера им заявил: в силу того, что мы настаиваем на изменении и укреплении правительства, мы не будем голосовать и против.

Новый глава Минприроды — Александр Козлов. В первую очередь в новой должности он намерен взяться за решение проблемы с переработкой мусора. Она ему знакома — до того, как стать министром, он успел побывать мэром и губернатором.

Госдума ожидает от всех министров эффективной работы, ведь теперь это и выбор парламентариев.

«Мы с вами, получив эти полномочия, получаем большую ответственность за принимаемые решения. Люди уже спросят с нас. Это кандидатуры, которые вносит председатель правительства, но утверждение относится к прерогативе парламента», — заявил председатель Госдумы Вячеслав Володин.

Буквально через несколько часов после того, как Госдума одобрила кандидатуры министров, Владимир Путин подписал указ о вступлении в должность.

Путин произвел кадровые перестановки в центральном аппарате МВД

Президент России Владимир Путин своим указом от 16 июля этого года произвел кадровые перестановки в МВД России. Генерал-полковник полиции 65-летний Михаил Ваничкин был освобожден от должности заместителя министра внутренних дел, на его место назначен генерал-лейтенант полиции 51-летний Андрей Храпов. По данным нашего источника, Ваничкин освобожден от должности по выслуге лет.

Михаил Ваничкин

Генерал-полковник полиции Михаил Ваничкин уже не первый раз покидает правоохранительные органы. В ходе реорганизации милиции в полицию в апреле 2011 года он ушел из системы с должности помощника министра внутренних дел. И чуть больше года проработал в московском Сбербанке на должности директора управления безопасности. А после назначения Владимира Колокольцева министром МВД (12 мая 2012 года) был назначен на должность его заместителем.

Надо отметить, что Ваничкин – профессионал с большой буквы. В правоохранительную систему пришел в 1980 году сразу после окончания Московской высшей школы милиции МВД СССР. Начинал карьеру обычным инспектором по борьбе с бандитизмом уголовного розыска.

На должности замминистра Ваничкин курировал большой блок в правоохранительной системе, а именно, отвечал за работу, связанную с борьбой криминальных структур. В его непосредственном подчинении находились Главки: уголовного розыска, экономической безопасности и противодействия коррупции, по противодействию экстремизму. Кроме этого он отвечал за работу Управления по безопасности лиц, находящихся под государственной защитой, Бюро специальных технических мероприятий, Оперативно-поискового бюро, Управления оперативо-разыскной информации и Национального центрального бюро Интерпола МВД.

По данным нашего источника, генерал-полковник был снят с должности «по выслуге лет, в силу своего возраста и здоровья». «На его место непросто было найти замену, ведь Михаил Георгиевич (Ваничкин) не просто курировал большой блок работ, он знал работу каждого направления, знал все тонкости. И нужно было найти достойную замену», – поделился собеседник. И добавил, что Ваничкин начал освобождать свой кабинет «задолго до подписания официального указа президента». «Он даже лично одобрил кандидатуру своего преемника Храпова и пожелал ему удачи на новом посту», – сказал источник.

Андрей Храпов

Генерал-лейтенант полиции Андрей Храпов уже обосновался в бывшем кабинете своего предшественника. Он пошел по стопам своего отца генерал-майора милиции в отставке Ивана Храпова, ушедшего из жизни в июне 2014 года.

Надо отметить, что Храпов также, как и Ваничкин, начинал свою карьеру в уголовном розыске, занимался в основном раскрытием заказных убийств. В апреле 2013 года Храпов был назначен на должность замначальника Главного управления уголовного розыска МВД России, где курировал борьбу с оргпреступностью. Через три года, в апреле 2016-го, он возглавил Главное управление по контролю за оборотом наркотиков МВД, где и работал до нового назначения.

Перестановки в «Россетях» подняли вопрос о выкупе «Ленэнерго» у Смольного

Переход Андрея Рюмина из «Ленэнерго» в головную компанию «Россети» актуализировал вопрос о консолидации в крупнейшей электросетевой компании РФ. АБН поговорило с экспертами о перспективах выкупа «Россетями» у Смольного доли в «Ленэнерго».

Инвесторы и эксперты активно заговорили о консолидации в «Россетях» после серии перестановок в энергетических компаниях. Как сообщало накануне АБН, и.о. гендиректора «Россети Ленэнерго» с 15 января назначен главный инженер компании Игорь Кузьмин.

Его предшественник Андрей Рюмин стал и. о. главы головной компании. Он сменил на посту гендиректора Павла Ливинского. Тот в свою очередь занял пост директора департамента энергетики правительства.

«Андрей Рюмин хорошо знаком с Павлом Ливинским, ранее они работали вместе. Вероятно, он продолжит выполнять стратегические задачи в «Россетях». Тема консолидации остается в фокусе, но она зависит не только от менеджмента и совета директоров компании, но и от позиции государства», — обращает внимание политтехнолог Марат Баширов.

Собеседник АБН добавляет, что Андрей Рюмин во время работы в Петербурге показал себя с хорошей стороны не только как управленец производственной деятельностью, но и как переговорщик с властями и инвесторами.

Андрей Рюмин / Фото: lenenergo.ru

Одной из главных заслуг экс-директора «Ленэнерго» стала именно консолидация активов петербургской сетевой компании. К маю прошлого года «Ленэнерго» присоединило АО «Курортэнерго», АО «Царскосельская энергетическая компания», АО «Петродворцовая электросеть» и АО «Санкт-Петербургские электрические сети».

Акции присоединенных компаний были конвертированы в акции ПАО «Ленэнерго». На фоне успешно проведенной реорганизации «Ленэнерго» многие эксперты и инвесторы ждут от Андрея Рюмина выполнения похожих задач уже в «Россетях».

Обсуждается в том числе выкуп доли администрации Петербурга в «Ленэнерго». Согласно сервису kartoteka.ru, город через комитет имущественных отношений владеет долей в 22,85% в сетевой компании.

Директор Фонда энергетического развития, член совета директоров «Ленэнерго» Сергей Пикин рассказал АБН, что не находит выкуп доли города целесообразным, если только Петербург не захочет дополнительно наполнить свой бюджет.

«С точки зрения стратегии управления сохранение доли города выглядит целесообразно, так как через пакет в «Ленэнерго» они управляют инфраструктурой. К тому же технологическая и управленческая консолидации уже прошли, компания функционирует в рамках единых бюджетов», — пояснил свое мнение Сергей Пикин.

Фото: baltphoto

Он также подчеркивает, что консолидация потребует дополнительных источников средств, причем довольно значительных. Администрация Санкт-Петербурга вряд ли будет продавать актив в убыток.

При этом даже на фоне сегодняшнего резкого роста стоимости акций «Ленэнерго» более чем на 20%, бумаги все равно торгуются на рынке гораздо дешевле той цены, по которой Смольный приобретал их.

Будут ли готово заплатить эту цену за консолидацию «Россети» и пойдет ли на продажу своей доли в «Ленэнерго» администрация Петербурга остается под большим вопросом. В свою очередь Марат Баширов не исключает такого сценария.

«Тут очень важны несколько обстоятельств. Первое — выгодность финансовой сделки. Второе – возможность города продолжать влиять на уровень тарифного регулирования. Третье — надежность электроснабжения в городе и способность компании наращивать объемы поставок при необходимости», — объясняет собеседник АБН.

По мнению политтехнолога, если администрация Петербурга и губернатор увидят, что продать долю в «Ленэнерго» можно без ущерба для развития города, его безопасности и социальных программ, то они могут рассмотреть такой вариант.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Перестановка

Катионные перегруппировки

В первой половине девятнадцатого века считалось, что реакции органических соединений протекают с минимальными структурными изменениями. Этот принцип упростил объяснение многочисленных реакций замещения, присоединения и элиминирования, которые характеризовали поведение общих функциональных групп.Однако последующие открытия показали, что природа не всегда была такой услужливой, оставляя химиков и студентов-химиков бороться с возможностью глубоких структурных изменений, происходящих во время определенных реакций. Большое количество этих структурных перестроек вызывается промежуточными продуктами, включающими положительно заряженные или электронно-дефицитные атомы, которые в случае углерода являются карбокатионами. Двумя такими примерами, как уже отмечалось, являются добавление HCl к 3,3-диметил-1-бутену и принудительный гидролиз неопентилбромида.В этой главе будут описаны и обсуждены другие случаи этой интригующей группы преобразований.

1. Перестановки Вагнера-Меервейна

Химическое поведение неопентилбромида, 2,2-диметил-1-бромпропана, является поучительным местом для начала этого обсуждения. Очень низкая реакционная способность этого 1º-бромида S _N 2 была отмечена ранее и объяснена стерическими препятствиями для требуемого 180º выравнивания реагирующих орбиталей. В условиях, благоприятствующих реакционной способности S _N 1, таких как раствор во влажной муравьиной кислоте, неопентилбромид реагирует примерно с той же скоростью, что и этилбромид.Оба эти соединения представляют собой 1º-алкилгалогениды, и для реакции S _N 1 стадия определения скорости требует ионизации до 1º-карбокатиона. Как указано в приведенном ниже порядке стабильности карбокатионов, такие карбокатионы относительно нестабильны и образуются медленно. Продуктом этилбромида является этанол, продукт простого и прямого замещения, но неопентилбромид дает 2-метил-2-бутанол вместо ожидаемого неопентилового спирта. Совершенно очевидно, что произошло изменение того, как пять атомов углерода в этом продукте связаны друг с другом.

Образовавшийся этильный катион может быть преобразован только в процессе замещения или отщепления.Однако в случае неопентильного катиона первоначально образованный 1º-карбокатион может быть преобразован в более стабильный 3º-карбокатион за счет 1,2-сдвига соседней метильной группы с ее связывающими электронами. Механизм, демонстрирующий такую ​​перестройку, показан ниже, и он очень хорошо объясняет общие структурные изменения.

Повышение стабильности промежуточных продуктов карбокатиона — не единственный фактор, который приводит к молекулярной перегруппировке. Если угловая деформация, скручивающая деформация или стерическое скопление в структуре реагента могут быть уменьшены за счет алкильного или арильного сдвига к сайту карбокатиона, такая перегруппировка обычно наблюдается.Следующие ниже примеры иллюстрируют перестройки, вызванные деформацией в маленьком кольце. Хотя первоначально образуется 3º-карбокатион, угол и деформация кручения четырехчленного кольца уменьшаются за счет сдвига метиленовой группы, что приводит к расширению кольца до 2º-карбокатиона. При нажатии на диаграмму уравнения отобразится механизм этих преобразований.

После стадии расширения кольца могут иметь место другие реакции, в зависимости от условий. В водной кислоте перегруппированный 2º-карбокатион может связываться с водным нуклеофилом, образуя 2º-спирт, терять протон в воду, давая 3,3-диметилциклопентен (не показан), или подвергаться второй перегруппировке в 3º-карбокатион, который затем образует 1,2-диметилциклопентен.Действительно, нередко можно встретить последовательности перегруппировок в более сложных соединениях, и они могут давать продукты со структурой, заметно отличающейся от структуры исходного соединения. Следующее уравнение показывает одну из таких реакций. Изогнутая стрелка, изображающая пять последовательных шагов расширения кольца, будет добавлена ​​к уравнению, если щелкнуть диаграмму.

В терминологии перициклических реакций 1,2-алкильные сдвиги такого типа классифицируются как [1,2] -сигматропные сдвиги .Поскольку это двухэлектронный процесс (2 электрона в перемещенной сигма-связи), предполагается, что перегруппировка будет надлицевой. Как показывает следующий пример, были получены значительные доказательства, подтверждающие этот вывод. Протонирование двойной связи дает 3º-карбокатион. Соседний атом водорода (окрашенный в синий цвет) смещается как гидридная составляющая, чтобы создать новый 3º-карбокатион, который, в свою очередь, вызывает сдвиг метильной группы (окрашен в зеленый цвет) с образованием еще одного 3º-карбокатиона.Этот электрофильный центр затем связывается с нуклеофильным кислородом функциональной карбоновой кислоты, высвобождая каталитический протон для продолжения процесса. Из-за слитой полициклической структуры этого соединения легко определяется относительная ориентация мигрирующих групп, и видно, что она является супрафациальной. Перестройки, состоящие из последовательных 1,2-сдвигов, часто происходят согласованным и, следовательно, стереоспецифическим образом; однако не следует предполагать, что групповые смены происходят одновременно.Каждый сдвиг включает отдельное переходное состояние, в котором положительный заряд делокализован по конечной точке миграции, исходной точке и мигрирующей группе.

Многие из наиболее интересных перегруппировок такого рода были обнаружены в ходе структурных исследований природных соединений. Среди них терпены представляли множество замечательных реакций, и имена двух химиков, которые сыграли важную роль в раскрытии их сложных превращений, Х. Меервейна и Г.Вагнера, постоянно связаны с этими перестановками. Добавление газообразной HCl к α-пинену оказалось особенно загадочным для этих первых химиков. В обычных условиях этот жидкий компонент скипидара давал кристаллическое соединение C ₁₀ H ₁₇ Cl, первоначально называвшееся «искусственной камфарой», теперь известное как борнилхлорид. Нестабильный изомер, гидрохлорид пинена, можно выделить в мягких условиях, но он быстро изомеризуется в борнилхлорид. Обработка борнилхлорида основанием дала кристаллический изомер пинена, называемый камфеном, вместе с небольшими количествами другого ненасыщенного углеводорода (борнилена).Добавление HCl к камфену аналогичным образом первоначально дает нестабильный хлорид (гидрохлорид камфена), который быстро изомеризуется в изоборнилхлорид, стереоизомер борнилхлорида. Теперь мы знаем, что борнилхлорид и изоборнилхлорид являются эндо / экзо-2-хлор изомерами 1,7,7-триметилбицикло [2.2.1] бициклогептановой системы. Структурные формулы этих соединений представлены ниже вместе с камфеном, перегруппированным продуктом отщепления.

Механизмы этих перестановок будут изображены при нажатии на диаграмму выше.На новом изображении мы видим, что и пинен, и камфен образуют 3º-карбокатионы, когда двойная связь протонирована. Перегруппировка в 2º-карбокатион способствует снятию напряжения небольших колец в случае пинена и облегчению стерического застоя в случае камфена. Однако это чрезмерное упрощение, которое игнорирует тот факт, что эти реакции происходят в неполярных растворителях, и вряд ли будут включать дискретные, несвязанные карбокатионы. Некоторые из стереоэлектронных эффектов, влияющих на эти реакции, будут показаны при повторном нажатии на диаграмму выше.Слева показаны структуры изначально образовавшихся нестабильных гидрохлоридов пинена и камфена. Оптимальное перекрытие орбиталей разрыва и образования связей требует приближения сдвигающейся алкильной группы с тыльной стороны к сайту уходящего хлорид-аниона аналогично реакции S _N 2. Хлорид-анион расположен на одной стороне карбокатиона, образованного алкильным сдвигом, и сразу же связывается с этой стороной трехкоординатного углерода. С этой точки зрения этих перегруппировок хлорид-анион никогда не избегает притягательного влияния своего катионного партнера, и стереоселективность продукта понятна.Кислотные катализаторы Льюиса (например, FeCl ₃ ) катализируют эти перегруппировки, и продукт, предпочтительный при равновесии, представляет собой борнилхлорид.
Перегруппировка, которая происходит в условиях отщепления, катализируемого основанием, отражает затененную конфигурацию двухуглеродного мостика, несущего атом хлора. Из-за этой конфигурации не может быть достигнута антикомпланарная структура, благоприятствующая переходному состоянию E2. Синхронное удаление дает небольшое количество борнилена, но преобладает перегруппировка до предшественника камфена.Повторное нажатие на приведенную выше диаграмму будет переключать дисплеи.

Еще один пример замечательных перегруппировок, катализируемых кислотой, которые происходят с терпенами, наблюдался при исследовании сесквитерпенового кариофиллена (из гвоздичного масла). Здесь очевидно, что реактивные центры могут взаимодействовать и образовывать связи от одной стороны кольца среднего размера к другой стороне. Механизмы многих таких перегруппировок изучались и до сих пор изучаются с большим интересом.

2.Перегруппировка Пинакола

Пинакольная перегруппировка была первой молекулярной перегруппировкой, идентифицированной как таковая ранними химиками. Определяющий пример перегруппировки пинакола показан на следующей диаграмме. Сам пинакол производится восстановлением ацетона магнием, вероятно, посредством промежуточного кетила. Поскольку диол симметричен, протонирование и потеря воды происходит с равной вероятностью по каждой гидроксильной группе. Полученный 3º-карбокатион относительно стабилен, и было показано, что он возвращается в пинакол в результате реакции в присутствии воды, меченной изотопами.Сдвиг 1,2-метила создает еще более стабильный карбокатион, в котором заряд делокализован за счет резонанса гетероатомов. Действительно, этот новый катион представляет собой просто сопряженную кислоту кетона пинаколона, который является продуктом повторяющихся перегруппировок, катализируемых переносом протона. Каждая стадия этой перегруппировки потенциально обратима, что продемонстрировано катализируемой кислотой дегидратации пинаколона (и пинакола) до 2,3-диметил-1,3-бутадиена в жестких условиях.

При анализе течения пинакольной перестройки необходимо учитывать множество факторов.К ним относятся:

• Какая гидроксильная группа теряется в виде воды? или Какой промежуточный карбокатион более стабилен?
• Какова внутренняя тенденция к смещению (миграционная способность) различных групп заместителей?
• Какое влияние на перегруппировку оказывают стерические затруднения и другие факторы деформации?
• Образуются ли эпоксиды как промежуточные соединения в пинакольной перегруппировке?
• Влияет ли стабильность продукта на результат конкурирующих реорганизаций?
• Выполните условия реакции (т.е.е. тип кислоты, концентрация, растворитель и температура) влияют на ход перегруппировки?

Было показано, что практически все эти факторы важны в одном или нескольких случаях, и полный анализ их сложного взаимодействия выходит за рамки этого текста. Тем не менее, несколько примеров будут представлены, чтобы продемонстрировать общий характер этого преобразования и проиллюстрировать действие некоторых из вышеупомянутых факторов. В первой реакции, показанной ниже, мы видим пример кинетического и термодинамического контроля продукта.При обработке слабой кислотой диол быстро перестраивается в альдегид путем сдвига 1,2-водорода в первоначально образовавшийся дифенил-3º-карбокатион. Более энергичная кислотная обработка диола или альдегида дает более стабильный фенилкетон (конъюгация фенильной и карбонильной групп). Механизмы этой и других реакций будут представлены при нажатии на диаграмму. Стрелка розового цвета обозначает перестановку; светло-голубые стрелки указывают на реакции замыкания или размыкания эпоксидного кольца.Повторное нажатие переключает реакцию и отображение механизма.
Во втором примере описывается аналогичная реагирующая система, которая предоставляет дополнительную информацию из стереохимических и изотопных характеристик мечения. Потеря воды из сайта 3º-карбинола с последующим обратимым 1,2-гидридным сдвигом приводит к образованию конъюгированной кислоты кетонового продукта. При коротких временах реакции рацемизация регенерированного исходного диольного материала происходит с той же скоростью, что и перегруппировка. Соответствующий фенильный сдвиг к первоначально образованному 3º-карбокатиону генерирует сопряженную кислоту с альдегидом, и было показано, что сам альдегид изомеризуется в такой же перегруппированный кетон в условиях этой перегруппировки пинакола.Изотопная углеродная метка (окрашенная в зеленый цвет) либо в диоле, либо в альдегиде перемешивается (окрашивается в коричневый цвет) в ходе этих реакций, что указывает на промежуточное соединение эпоксида.

В реакции № 3 в качестве реагента можно использовать цис- или трансдиол. Эти изомеры быстро взаимопревращаются в условиях перегруппировки, указывая на то, что начальная потеря воды обратима; результат подтвержден изотопным кислородным обменом. Явное предпочтение сдвигу метиленовой группы по сравнению со сдвигом метильной группы может отражать присущие им миграционные способности или, возможно, групповые конфигурации в промежуточном 3º-карбокатионном промежуточном продукте.В показанной здесь конформации могут сдвигаться как метильная, так и метиленовая группы, или может образовываться эпоксидное кольцо обратимо. Альтернативная конформация в виде кресла, имеющая экваториальную метильную группу, должна быть более стабильной, но не подходящей для метильного сдвига. Таким образом, понятно преобладающее сокращение кольца. Реакция №4 — необычный случай, когда напряженное кольцо сжимается до еще меньшего кольца. Фенильные группы обычно обладают высокой способностью к миграции, поэтому невозможность получить 2,2-дифенилциклобутанон в качестве продукта может показаться неожиданным.Однако карбокатион, возникающий в результате фенильного сдвига, будет таким же напряженным, как и его предшественник; тогда как сдвиг кольцевой метиленовой группы генерирует ненапряженный катион, стабилизированный фенильными и кислородными заместителями. Конъюгативная стабилизация фенилкетона и отсутствие гибридизированных атомов углерода sp ² в малом кольце также могут способствовать стабильности наблюдаемого продукта.
Наконец, реакция № 5 ясно показывает влияние условий реакции на состав продукта, но сложно объяснить, каким образом различные условия влияют на результат.Обработка холодной серной кислотой должна давать более стабильный дифенил-3º-карбокатион, и тогда смещение метильной группы приведет к наблюдаемому продукту. С другой стороны, действие кислоты Льюиса в уксусном ангидриде может избирательно ацетилировать менее затрудненный диметилкарбинол. В этом случае ацетат становится предпочтительной уходящей группой (предположительно координированной с кислотой), за которой следует 1,2-фенильный сдвиг. Сообщается, что симметрично замещенный изомерный диол (показан в заштрихованной рамке) перегруппировывается исключительно за счет метильного сдвига, но конфигурация исходного материала не указана (возможны два диастереомера).
Из-за влияния других факторов (см. Выше) невозможно определить однозначный порядок миграции заместителей в перегруппировке пинакола. Однако можно выделить некоторые общие тенденции. Бензопинакол, (C ₆ H ₅ ) ₂ C (OH) C (OH) (C ₆ H ₅ ) ₂ , подвергается быстрой перегруппировке в (C ₆ H ₅ ) ₃ CCOC ₆ H ₅ в гораздо более мягких условиях, чем требуется для пинакола.Действительно, часто бывает, что фенил или другие ароматические заместители, соседние с образующимся карбокатионом, будут способствовать этой ионизации в ходе их миграции к катионному участку. В неароматических соединениях типа (CH ₃ ) ₂ C (OH) C (OH) RCH ₃ миграция R возрастает следующим образом: R = CH ₃ 2H ₅ 3) ₃ ° C. Поскольку замещающая алкильная группа должна нести часть общего положительного заряда, алкильное замещение должно оказывать стабилизирующее влияние на переходное состояние перегруппировки.Наконец, замещение фтора, как в C ₆ H ₅ (CF ₃ ) C (OH) C (OH) (CF ₃ ) C ₆ H ₅ , делает диол неактивным под действием кислотного катализатора. условия перестановки. Здесь мощный индукционный отвод электронов фтором препятствует образованию положительного заряда.

3. Перестановка Тиффно-Демьянова

Неопределенность в определении начального места образования карбокатиона представляет проблему при анализе многих перегруппировок пинакола.Эта неопределенность может быть устранена путем дезаминирования азотистой кислотой соответствующих 1º-аминоспиртов, как показано в следующем уравнении. Поскольку эту реакцию обычно проводят в очень мягких условиях, вероятность того, что последующие превращения могут скрыть начальную перегруппировку, значительно снижается.

Перегруппировка Тиффно-Демьянова часто используется для превращения циклического кетона в гомолог, который на один размер кольца больше. Такое применение, которое осуществляется посредством промежуточного циангидрина, показано в первом примере ниже.Циклические кетоны имеют два альфа-углеродных атома, каждый из которых может переходить в формирующийся 1º-карбокатион. Если в показанном здесь случае R = H, эти две группы идентичны и при сдвиге дают одинаковый продукт. Если R = CH ₃ , 2º-алкильная группа предпочтительно смещается, причем основным продуктом является 3-метилциклогексанон; 2-метильный изомер является второстепенным продуктом. Вторая реакция информативна, поскольку демонстрирует, что хиральная 2º-бутильная группа перемещается с сохранением конфигурации.

Третий пример иллюстрирует важность конфигурации подложки в процессе перегруппировки.Начальную стадию сдвига арильной группы в соседний сайт карбокатиона можно рассматривать как внутримолекулярное электрофильное замещение типа Фриделя-Крафтса. Приближение арильного кольца со стороны, противоположной отходящему азоту иона диазония, приводит к образованию промежуточного соединения иона фенония (показано в скобках выше), структура которого подобна иону бензолония. В этих двух примерах диастереомерные реагенты предпочтительно приводят к диастереомерным промежуточным соединениям, даже несмотря на то, что анизильная группа имеет гораздо большую способность к миграции, чем фенил.Донорство электронной пары гидроксильным заместителем затем действует, открывая трехчленное кольцо этих промежуточных соединений, давая кетоновые продукты.

4. Анхимерная помощь

При измерении скорости сольволиза алкилгалогенидов и сложных эфиров сульфоновой кислоты наблюдаются любопытные влияния соседних заместителей. Например, этилхлорид, неопентилхлорид (2,2-диметилпропилхлорид) и 2,2,2-трифенилэтилхлорид — все это 1º-алкилхлориды, которые гидролизуются во влажной муравьиной кислоте до смесей спиртов и олефинов (S _N 1 & E1 механизмы).Скорости реакции для этилхлорида и неопентилхлорида почти идентичны, но трифенильное соединение реагирует в 60 000 раз быстрее. Уравнения для последних двух сольволизов показаны на следующей диаграмме. Очевидно, что в обоих случаях первоначально образованный 1º-карбокатион перегруппировался до образования продукта, как показано при нажатии на диаграмму. Однако повышенная скорость фенилзамещенного соединения вызывает недоумение, особенно с учетом большей электроотрицательности фенильных групп по сравнению с метилом (обратите внимание, что дифенилуксусная кислота более чем в девять раз кислотнее изомасляной кислоты).Чтобы объяснить неожиданную реакционную способность 2,2,2-трифенилэтилхлорида, предполагается, что пи-электроны подходящей фенильной группы способствуют ионизации 1º-хлорида за счет образования связи со стороны, противоположной связи C-Cl, как показано щелкнув по диаграмме второй раз. Это внутримолекулярное взаимодействие соответствует последнему примеру в предыдущем разделе и аналогично внутримолекулярной реакции S _N 2. Образовавшийся ион фенония немедленно откроется для 3º-карбокатиона, в котором вспомогательная фенильная группа переместится в соседнее положение.Таким образом, соседнее ароматическое кольцо ускоряет определяющую скорость (эндотермическую) стадию ионизации, влияние, называемое анхимерной поддержкой (греч .: anchi = сосед).

Следующие ниже энергетические профили этих реакций иллюстрируют последовательность событий. Обе реакции начинаются с начальной стадии ионизации, определяющей скорость, переходное состояние которой окрашено в розовый цвет. Энергия активации для этой стадии больше для неопентилхлорида, потому что она приводит к дискретному 1º-карбокатиону.С другой стороны, ионизация трифенилэтилхлорида происходит при содействии соседней фенильной группы, и образующийся ион фенония немедленно открывается для очень стабильного дифенил-3º-карбокатиона. Вторая стадия сольволиза неопентилхлорида — это быстрая перегруппировка 1º-карбокатиона в изомерный 3º-карбокатион. Переходное состояние для этой перестановки окрашено в зеленый цвет. В обоих случаях промежуточный 3º-карбокатион в конечном итоге диспропорционирует до смеси продуктов замещения и элиминирования.Существенное отличие состоит в том, что ионизационное переходное состояние для неопентилхлорида страдает всеми недостатками, связанными с образованием 1º-карбокатиона; тогда как переходное состояние для ионизации трифенилэтилхлорида имеет пониженную энергию из-за его феноний-подобного характера.

Анхимерная помощь не только проявляется в усилении ионизации, но и влияет на стереохимический исход реакций. Примером может служить ацетолиз диастереомерных производных 3-фенил-2-бутанола.Этот спирт имеет два хиральных центра и, следовательно, имеет четыре стереоизомера в виде двух пар энантиомеров. Диастереомерные конфигурации называются эритро и трео в соответствии с их корреляцией с тетрозами эритрозой и треозой. Как правило, эритроизомеры могут принимать затененную конформацию, в которой идентичные или похожие заместители в двух стереогенных сайтах затмевают друг друга. Треоизомеры не могут принимать такую ​​конформацию. На следующей диаграмме тозилатное производное одного энантиомера каждого диастереомера изображено в виде проекции Фишера.Эти изомеры сольволизовали в горячем растворе уксусной кислоты, забуференном ацетатом натрия, и определяли конфигурации образующихся эфиров ацетата. Как и ожидалось в процессе S _N 1, было также получено некоторое количество продукта удаления E1. Примечательно, что каждый диастереомер превращается в его эквивалентный диастереомерный ацетат (сохранение конфигурации). Кроме того, эритросоединение сохраняет свою энантиомерную чистоту; тогда как треотозилат дает рацемический ацетат и сам рацемизируется во время реакции.Если бы в этих реакциях образовывался промежуточный открытый карбокатион, от обоих тозилатов можно было ожидать смеси эритро- и треоацетатов, но среди продуктов были обнаружены только следовые количества противоположного диастереомера.

При нажатии на диаграмму будет продемонстрировано контролирующее влияние анхимерной помощи фенильной группы. Во-первых, молекула принимает конформацию, в которой фенильный заместитель ориентирован против тозилатной группы. Затем пара пи-электронов от бензольного кольца связывается с С2, когда тозилат-анион уходит, образуя промежуточное соединение фенония (в скобках).Промежуточный продукт из эритротозилата хиральный, а из треотозилата — ахиральный (обратите внимание на плоскость симметрии, разделяющую трехчленное кольцо пополам). В каждом случае C2 и C3 конституционально эквивалентны, и нуклеофильная атака ацетат-анионом происходит одинаково хорошо в любом положении (зеленые и голубые стрелки). В результате равных скоростей образования продукта за счет связывания ацетата с C2 и C3, ахиральный трео-промежуточный продукт дает 50:50 (рацемическую) смесь энантиомеров трео: (2R, 3S) из синих стрелок и (2S, 3R) из зеленые стрелки.Напротив, связывание ацетата с C2 и C3 промежуточного эритропродукта дает такой же энантиомер эритропродукта (2S, 3S). Поскольку первоначальная ионизация до фенониевых промежуточных продуктов обратима, мы не удивлены, обнаружив, что непрореагировавший эритротозилат не изменился; тогда как непрореагировавший треотозилат рацемизируется.

5. Анхимерная помощь со стороны других соседних групп

Способность пи-электронов в подходящем соседнем бензольном кольце способствовать ионизации C-X, где X представляет собой галоген или сложный сульфонатный эфир, была описана в предыдущем разделе.Другие ароматические кольца, такие как нафталин, фуран и тиофен, могут действовать аналогичным образом, как и пи-электроны двойных и тройных связей. На следующей диаграмме показаны три примера взаимодействия соседних двойных связей, первый из которых является одним из самых ярких случаев анхимерной помощи за всю историю наблюдений. Пунктирные линии показывают делокализацию заряда — обычная практика. Текстовое поле под диаграммой содержит дополнительные комментарии к этим примерам.

Примеры других возмущений соседних групп, включая помощь несвязывающей электронной пары соседними атомами серы, кислорода и азота, будут показаны выше при нажатии соответствующей кнопки под диаграммой.Комментарий текстового поля изменится в соответствии с примерами. В большинстве случаев с участием гетероатома образуется «ониевый» интермедиат, в котором гетероатом заряжен. Соседние атомы галогена могут также стабилизировать карбокатионы, как отмечалось ранее в отношении транс-анти добавок к циклическим алкенам. Сообщалось также о функциональной перестройке с помощью промежуточных соединений галония. Например, раствор диаксиального 2-бром-3-хлоростероида в хлороформе, показанный слева внизу, самопроизвольно перестраивается в более стабильный диэкваториальный 2-хлор-3-бром-изомер, изображенный справа.Перегруппировка обратима и происходит по циклическому иону бромония, указанному в скобках.

6. Неклассическая гипотеза карбокации

Роль промежуточных продуктов карбокатиона во многих органических реакциях хорошо известна. Некоторые, например трет-бутил, локализованы. Некоторые из них, такие как аллил и бензил, стабилизируются сопряжением с пи-электронными системами. Некоторые из них, как описано выше, стабилизируются за счет связывания с соседними нуклеофилами.Во всех случаях анхимерной помощи, описанной выше, частицы с делокализацией или перераспределением заряда являются промежуточными на пути реакции. Такие промежуточные продукты могут быть изолированы в некоторых случаях, но обычно они существуют только временно. Ускорение скорости ионизации объясняется структурным и энергетическим сходством переходных состояний с промежуточными продуктами, которые они производят (постулат Хаммонда).

Анхимерная помощь обычно связана с одной или несколькими из следующих наблюдаемых характеристик.

• Оцените ускорение по сравнению с аналогичными реакциями без помощи.
• Стереоэлектронный контроль, который приводит к различиям в скорости и продукте между стереоизомерами.
• Сохранение конфигурации в заменяемых продуктах.
• Рацемизация продуктов (и часто реагентов), когда участвует симметричный мостиковый промежуточный продукт.

Сольволиз экзо- и эндо-2-норборнилсульфонатных эфиров выявил различия, которые предполагают анхимерную помощь экзо-изомеру.Как показано на следующей диаграмме, скорость ацетолиза экзо-изомера значительно выше, чем скорость эндо-изомера, который реагирует со скоростью, аналогичной циклогексильному производному. Первая замена протекает с полным сохранением конфигурации и рацемизации; тогда как эндо-изомер замещен с инверсией конфигурации и сохраняет небольшую степень оптической активности. Источником этой помощи была предложена электронная пара сигма-связи C1: C6, которая идеально ориентирована против уходящей сульфонатной группы.Сигма-делокализованный ион (показан в скобках) был предложен в качестве промежуточного звена, отображаемого при нажатии на диаграмму. Поскольку этот мостиковый ион является симметричным, ожидается образование рацемического ацетата. Термин «неклассический» был применен к этому катиону с делокализацией заряда, поскольку он оказался уникальным.
Для сравнения, эндо-изомер ионизируется до классического 2º-карбокатиона, который быстро превращается в более стабильный неклассический ион. Некоторое количество ацетат-аниона может связываться с 2º-карбокатионом до того, как он изменится, что объясняет остаточную оптическую активность в этой реакции.

Не всех убедила такая интерпретация свидетельств. Главными сторонниками неклассического взгляда были С. Винштейн и Дж. Д. Робертс. Основная оппозиция исходила от Г. К. Брауна, который придерживался более традиционной рационализации. Браун указал, что норборнильные соединения лучше по сравнению с циклопентилом, чем с аналогами циклогексила (затмевающий штамм), и в таком сравнении эндо-изомер аномально медленный, а экзо-изомер только в 14 раз быстрее, чем циклопентил.Рацемический продукт был объяснен предположением, что взаимное превращение энантиомерных классических карбокатионов происходит очень быстро по шкале времени реакции. Браун также отметил, что присоединение стабилизирующего арильного заместителя к C2 не снижает скорости увеличения экзоионизации или предпочтения образования экзо-продукта. Поскольку эти последние сольволизы протекают посредством бензильного катиона, предполагается, что содействие сигма-связи будет минимальным. Следовательно, повышение скорости и сохранение конфигурации становятся менее значимыми как неклассические индикаторы.Этот последний эксперимент, в котором арильным заместителем был п-анизил (An), изображен в левой части диаграммы ниже.

Несмотря на разрушительные аргументы Брауна, другие эксперименты предоставили дополнительную поддержку неклассической точке зрения. Как показано в правой части диаграммы, электроноакцепторные заместители на C6 ( ² R) замедляют экзореактивность сильнее, чем эндореактивность. Аналогичный эффект был отмечен для таких заместителей при C1 ( ¹ R).Это влияние лучше всего объясняется неклассической гипотезой, согласно которой частичный положительный заряд должен нести C1, C2 и C6.

Интерпретации значительного количества доказательств, собранных на этом этапе, можно обобщить на диаграмме справа. На первом дисплее неклассический мостиковый катион показан как переходное состояние для взаимного превращения классических карбокатионов. Такое соотношение соответствует перегруппировке неопентилхлорида.Вторая возможность, представленная щелчком по диаграмме, имеет неклассический ион в качестве промежуточного звена с более высокой энергией, связывая классические ионы. Наконец, если щелкнуть диаграмму второй раз, можно увидеть возможность того, что неклассический ион представляет собой более стабильное промежуточное соединение.
К середине 1960-х химические методы и методы ЯМР были усовершенствованы до стадии, которая позволила напрямую наблюдать карбокатионы в низконуклеофильных кислых растворах, часто называемых «суперкислотами». Большая часть этой работы была проведена Джорджем Олахом (Нобелевская премия, 1994) с использованием смешанных растворителей, состоящих из SbF ₅ , SO ₂ , SO ₂ F ₂ и SO ₂ FCl.При низких температурах были получены и интерпретированы спектры ЯМР ¹ H и ¹³ C для (CH ₃ ) ₃ C (+) и (CH ₃ ) ₂ CH (+). Как и ожидалось, заряженный трехкоординатный атом углерода демонстрировал сигнал ¹³ C более 300 ppm в слабом поле от TMS. Когда аналогичные измерения ЯМР были применены к 2-норборнильному катиону, был обнаружен ряд быстрых протонных сдвигов. Их можно «заморозить», работая при низкой температуре, 3,2-смену при -70 ° C и более быструю 6,2-смену при -130 ° C.Результирующий спектр, который оставался неизменным при температурах до -160 ° C, не имел сигналов слабого поля, близких к ожидаемым для классического 2 °-карбокатиона, и свидетельствовал о неклассической структуре. Недавно твердотельные спектры ЯМР ¹³ C при 5 ° K подтвердили соответствие неклассическому иону. На основании этих и других спектроскопических исследований неклассический катион с сигма-мостиковым мостиком был твердо идентифицирован как более стабильная разновидность карбокатиона, имеющая 2-норборнильную структуру. Дальнейшее подтверждение было получено в 2013 году исследователями из Германии, проведенными с помощью тщательных рентгеновских кристаллографических измерений отожженной [C ₇ H ₁₁ ] ⁺ [Al ₂ Br ₇ ] ^— соли при 40º. К.
Существуют ли другие относительно стабильные неклассические карбокатионы? Было идентифицировано несколько, которые, кажется, соответствуют этой классификации, но немногие из них были изучены столь же исчерпывающе, как 2-норборнил. Один из лучших критериев для оценки ионов-кандидатов — установить, являются ли один или несколько участвующих атомов углерода гипервалентными (имеют более четырех координирующих групп). На следующей диаграмме простейший гипервалентный карбокатион, метаноний, изображен слева в серой заштрихованной рамке.Этот ион обычно наблюдается в масс-спектре метана (газовая фаза), но разлагается в растворе из-за его чрезвычайной кислотности. Справа от него находятся два более крупных неклассических иона, 2-норборнил и 7-норборненил. В каждом случае идентифицируется пятикоординированный атом углерода. Вкладчики резонанса в эти ионы показаны справа от пунктирной связи, и на всех рисунках делокализованная электронная пара окрашена в синий цвет. Наконец, широкий обзор этой классификации, предложенный Олахом в его Нобелевской лекции, будет показан при нажатии на диаграмму.

Посмотреть модель 2-норборнильного катиона.

Перегруппировки в электронодефицитные гетероатомы

1. Перегруппировки катионного кислорода

Протонирование двухвалентного атома кислорода спиртов и простых эфиров сильными кислотами дает трехкоординатный оксониевый катион . Поскольку кислород иона оксония имеет октет валентной оболочки, он не является электронно-дефицитным сайтом и не может служить концом перегруппировки.Чтобы вызвать перегруппировку так же, как трехкоординатный карбокатион, кислород должен быть преобразован в однокоординатный оксакатион , как показано на следующей диаграмме. Сдвиг 1,2-алкила или арила затем превращает относительно нестабильный оксакатион в более стабильный карбокатион.

Простейшим предшественником окса-катиона является пероксид или эквивалентное производное (например, R-O-OH или R-O-X). Удаление гидроксид-аниона из гидропероксида является энергетически невыгодным, если он изначально не превращается в более удаляемую группу способом, аналогичным тому, который используется для облегчения реакций замещения спиртов.При протонировании гидроксильной группы уходящая группа становится водой, вызывая, таким образом, оксакатион. На этой стратегии основана полезная промышленная методика получения фенола (и ацетона).

Перегруппировка Байера-Виллигера

Катализируемая кислотой реакция кетонов с гидропероксидными производными известна как реакция Байера-Виллигера . Общее уравнение, иллюстрирующее эту реакцию окисления, показано ниже, и можно отметить, что стадия перегруппировки аналогична стадии перегруппировки пинакола.Сложные эфиры или лактоны являются основными продуктами кетоновых реагентов. В этом уравнении дискретный оксакатион изображен в качестве промежуточного звена, но более вероятно, что перегруппировка согласована, как будет показано при нажатии на уравнение. После добавления перкислоты к карбонильной группе перегруппировка может быть облегчена за счет внутримолекулярной водородной связи, как показано в скобках справа.
Способность к миграции различных групп заместителей (например, ¹ R и ² R) обычно составляет: 3º-алкил> 2º-алкил ~ бензил ~ фенил> 1º-алкил> метил .Стереоэлектронные факторы способствуют антиперипланарной ориентации мигрирующей группы по отношению к уходящей части и в некоторых случаях будут контролировать перестройку. Пример будет показан ниже при повторном щелчке по дисплею. Обмен надкислот с перуксусной кислотой приводит к внутримолекулярной реакции Байера-Виллигера посредством бициклического ацилпероксида, указанного в скобках. Здесь стереоэлектроника способствует миграции менее замещенного α-углерода. Лактонный продукт идентифицировали этерификацией и эфирным обменом с метанолом с получением метил-2-карбометокси-7-гидроксигептаноата.
Альдегиды обычно окисляются до карбоновых кислот в условиях, используемых для реакции Байера-Виллигера.

Хотя перекись водорода сама по себе может использоваться в реакции Байера-Виллигера, она может присоединяться на обоих концах к реакционноспособным карбонильным группам, давая циклические димерные, тримерные и соединения с более высокой степенью присоединения. Следовательно, производные, такие как перкислоты (Z = RCO и ArCO выше), являются предпочтительными реагентами для этой реакции. Среди наиболее распространенных надкислот, используемых в этом отношении: перуксусная кислота, пербензойная кислота и мета -хлорпербензойная кислота (MCPBA).Четыре примера этой окислительной перегруппировки приведены на следующей диаграмме. В большинстве этих примеров мигрирующая группа сохраняет свою конфигурацию в ходе перегруппировки, как и ожидалось для согласованного процесса. В примере № 3 интересно, что миграция 3º -алкильной группы мостика является предпочтительной по сравнению с возможным фенильным сдвигом.

Некоторые окислительные перегруппировки Байера-Виллигера

2. Перегруппировки катионного или электронодефицитного азота

Поскольку многие простые соединения азота являются основаниями, при протонировании они образуют «ониевые» катионы.Два таких катиона показаны слева (в синей рамке) ниже. Поскольку катионы аммония и иминия имеют октет электрона валентной оболочки азота, такой атом азота не может служить местом для нуклеофильной связи или концом миграции. Чтобы катион азота инициировал перегруппировку, он должен иметь незаполненную валентную оболочку, и два таких азакатиона показаны в центре диаграммы (розовая рамка). Электронно-дефицитный атом азота не обязательно должен быть катионом, как показывает пример нитрена справа (зеленая рамка).

Перегруппировка Бекмана

Если гидроксильная группа кетоксима удаляется под действием сильной кислоты или пентахлорида фосфора с последующим гидролизом, образуется амид. Полное удаление дериватизированной гидроксильной группы и ее пары связывающих электронов привело бы к двухвалентной sp-гибридизации азакатионов типа, изображенного на предыдущей диаграмме. Если бы это произошло, оба углеродных заместителя ( ¹ R и ² R) были бы кандидатами для последующего 1,2-сдвига.Однако на практике всегда группа, направленная против отходящего ОН, мигрирует в азот. Эта стереоспецифичность указывает на то, что 1,2-сдвиг согласован с расщеплением N-O, как показано ниже. Полученный промежуточный N-алкилированный нитрил будет реагировать с нуклеофилами (например, с водой) у электрофильного атома углерода, соседнего с «ониевым» азотом. Обратите внимание, что структура, нарисованная для этого промежуточного продукта, является более предпочтительной из двух вкладчиков резонанса, поскольку все тяжелые атомы имеют заполненные октеты валентной оболочки.Присоединение нуклеофила к атому азота потребовало бы расширения его валентной оболочки до десяти электронов или образования нестабильных диполярных частиц. Исходным продуктом гидратации на углероде является иминол, который немедленно таутомеризуется с образованием более стабильного амида. Реакции с PCl ₅ , вероятно, дают иминохлорид, который, в свою очередь, гидролизуется до того же амида.

Первым примером в следующей группе реакций является типичная перегруппировка Бекмана.Оксим из циклогексанона имеет идентичные карбонильные заместители. и поэтому существует как единственный изомер. Продукт перегруппировки представляет собой лактам (циклический амид), который может быть гидролизован до омега-аминокислоты. Этот лактам служит важным промышленным предшественником нейлона 6. Второй пример включает производное оксима с различными карбонильными заместителями, которое существует в виде пары стереоизомеров (син и анти). Анти-изомер перестраивается за счет 1,2-фенильного сдвига, тогда как син-изомер претерпевает 1,2-изопропиловый сдвиг.Первая реакция протекает намного быстрее, чем вторая, предположительно потому, что она протекает через относительно стабильный промежуточный ион фенония (структура в заштрихованной рамке). Обратите внимание, что уходящая пикратная группа (2,4,6-тринитрофенолят) является стабильным анионом. Пример № 3 — еще один случай, демонстрирующий стереоспецифичность перегруппировки Бекмана. 1,2-сдвиг ортофенольного заместителя происходит быстрее, чем сдвиг незамещенной фенильной группы, и гидроксил идеально расположен для связи с электрофильным углеродом промежуточного соединения.Следовательно, продукт анти-изомера представляет собой бензоксазольный гетероцикл.

Четвертый пример, приведенный выше, показывает необычное расхождение в поведении, которое иногда происходит, когда мигрирующие фрагменты заместителя от промежуточного соединения оставляют нитрил в качестве стабильного продукта. Это было названо ненормальной реакцией Бекмана.

Жесткая конфигурация катиона фенония, показанная выше, налагает структурные ограничения, которые хорошо демонстрируются скоростями перегруппировки некоторых бициклических соединений с конденсированным кольцом.Щелкнув по диаграмме, вы увидите результаты такого исследования. Исследованы оксимные производные фенилкетонов, входящие в шестичленные, семичленные и восьмичленные конденсированные кольца. Из-за углеродной цепи, соединяющей оксимную функцию с ортоуглеродом бензольного кольца, ион фенония, который обычно способствует миграции фенила, может не иметь своей предпочтительной структуры (трехчленное кольцо, ортогональное фенильному кольцу). Трехуглеродная мостиковая цепь для n = 6 является таким случаем, и перегруппировка анти-изомера происходит очень медленно.По мере увеличения длины мостиковой цепи ее ограничение становится менее жестким, и скорость перегруппировки увеличивается. Восьмичленный пикрат оксима быстро гидролизуется с образованием девятичленного лактама с высоким выходом.

Перегруппировки типа Beckmann также могут быть выполнены путем обработки гидразонов азотистой кислотой. , как показано справа.Как правило, это менее желательная процедура, поскольку чистые гидразоны получить труднее, а выход чистого продукта ниже.
Прямая перегруппировка кетонов, тем самым избегая необходимости получения производного, возможна с помощью процедуры, известной как перегруппировка Шмидта . Катализируемое кислотой присоединение азотной кислоты к карбонильной группе кетона создает нестабильный азидокарбинол, который при дегидратации дает тот же триазониевый катион, предположительно образующийся в качестве промежуточного соединения при дезаминировании азотистой кислоты гидразона.Перегруппировка этого вида путем быстрой потери азота затем инициирует перегруппировку, подобную Бекманну. Если щелкнуть верхнюю диаграмму второй раз, будут представлены два примера перегруппировки Шмидта.

Перегруппировка Стиглица

Примеры перегруппировок в sp ² гибридизированных азакатионов относительно редки по сравнению с их углеродными аналогами. Исходными материалами для получения таких азакатионов обычно являются хлорамины или гидроксиламины. Ниже показаны четыре примера этих преобразований, иногда называемых «перестановками Штиглица».Первый пример подобен перегруппировке Вагнера-Меервейна, а второй — пинакольной перегруппировке. Конкурентные сдвиги пара-замещенных фенильных групп в реакциях, подобных примеру № 3, демонстрируют, что метокси-заместитель облегчает перегруппировку, тогда как нитрозаместитель ее замедляет. В последнем примере сопряженный азакатион активирует бензольное кольцо до нуклеофильного замещения, в отличие от обычной роли аминовых заместителей.

Перегруппировка ацилнитренов в изоцианаты

Несколько полезных и общих процедур разложения производных карбоновой кислоты до аминов включают перегруппировку ацилнитрена в изоцианат.Хотя атом азота нитрена не имеет формального заряда, он электронно-дефицитный и служит локусом для 1,2-перегруппировок. Как показано на следующей диаграмме, ацилнитрены могут быть получены из различных амидоподобных исходных соединений. После образования ацилнитрены быстро перегруппируются в относительно стабильные изомеры изоцианата, которые могут быть выделены или подвергнуты реакции с гидроксильными растворителями. Наиболее частое применение этой перегруппировки — синтез аминов. Таким образом, добавление воды к кетеноподобным изоцианатам дает нестабильную карбаминовую кислоту, которая разлагается на амин и диоксид углерода.Общие процедуры получения предшественников нитрена перечислены под диаграммой.

Hofmann Route: Первичные амиды превращаются в N-галогенированные производные под действием HOX или X ₂ в щелочном растворе. Избыточное основание образует сопряженное основание продукта.
Lossen Route: Производное гидроксамовой кислоты (RCONHOH) получают в результате реакции сложного эфира с гидроксиламином. Гидроксамовая кислота подвергается O-ацилированию, а затем превращается в ее конъюгированное основание.
Курциус Маршрут: Ацилазид (RCON ₃ ) получают одним из двух способов. (i) Реакция ацилхлорида с азидом натрия или (ii) Реакция сложного эфира с избытком гидразина с последующей реакцией ацилгидразидного продукта (RCONHNH ₂ ) с холодной азотистой кислотой. Ацилазиды при нагревании разлагаются до изоцианатов.
Schmidt Route: Вариант процедуры Курциуса, в котором карбоновая кислота нагревается с азойной кислотой (HN ₃ ) и кислотным катализатором.

Некоторые примеры этих различных перестановок показаны на следующей диаграмме. В каждом случае зеленая заглавная буква (C, H, L или S) обозначает тип реакции. Первые три реакции иллюстрируют перегруппировку Хофмана, которая является особенно полезным методом получения аминов. В последнем примере показана реакция Курциуса на сложный диэфир в виде промежуточного бис-ацилгидразида. Также показан альтернативный подход Куртиуса к аминовому продукту из примера №2.Процедура Куртиуса особенно полезна, если желаемым продуктом является изоцианат, поскольку разложение промежуточного ацилазида можно проводить в отсутствие гидроксильных растворителей, которые могли бы реагировать с изоцианатом.

Еще пять примеров будут отображены выше, если щелкнуть диаграмму. Пример № 5 показывает реакцию Шмидта, в которой оптически активная карбоновая кислота является субстратом. S-конфигурация мигрирующей фенэтильной группы сохраняется в аминовом продукте, подтверждая внутримолекулярный характер этих перегруппировок.Сохранение конфигурации наблюдается также в перегруппировках Курциуса, Лоссена и Гофмана. Реакции №6 и №7 представляют собой интересные случаи, в которых вода отсутствует во время образования и реакции изоцианата. Спиртовой растворитель в №6 добавляется к изоцианату с образованием сложного эфира карбамата, известного как уретан . В отличие от нестабильных карбаминовых кислот уретаны не разлагаются и могут быть выделены в виде чистых соединений. Если бы вода была растворителем, полученный 1º-енамин перегруппировался бы в имин и гидролизовал бы до альдегида.В перегруппировке Лоссена (# 7) бутиламин добавляется к изоцианату с образованием замещенной мочевины (мочевина — NH ₂ CONH ₂ ).
Перегруппировка Хофмана в реакции № 8 представляет собой новый пример таутомерии ацетиленового 1º-амина в нитрил. Наконец, последний пример иллюстрирует селективную перегруппировку Гофмана бромимида. Реакционная способность пара карбонильной группы к электроноакцепторному нитрозаместителю увеличивается по сравнению с другим имид-карбонилом.Следовательно, здесь предпочтительно происходит катализируемый основанием гидролиз, оставляя ацилнитреновый фрагмент мета для нитрофункции.

Перегруппировки ацилкарбенов

1. Реакция Арндта-Эйстерта

Перегруппировка ацилнитренов в изоцианаты, которая является сутью перегруппировок Гофмана, Курциуса и Лоссена, проходит параллельно с перегруппировкой ацилкарбенов в кетены, превращением, называемым перегруппировкой Вольфа .Эта перегруппировка является критическим этапом в процедуре Arndt-Eistert для удлинения карбоновой кислоты одним метиленовым звеном, как описано на диаграмме ниже. Исходная кислота, указанная слева, превращается сначала в производное ацилхлорида, а затем в диазометилкетон. Диазометан имеет нуклеофильную метиленовую группу, как показано резонансными формулами, нарисованными в заштрихованной рамке. Ацилирование метиленового углерода дает равновесную смесь разновидностей диазония и диазометилкетона плюс хлористый водород (указано в скобках).Если HCl не нейтрализуется основанием, эта смесь реагирует дальше с образованием хлорметилкетона с потерей азота. Однако, если HCl нейтрализуется по мере его образования, получается относительно стабильный диазокетон, который может быть использован в последующих реакциях.
Поскольку сам диазометан может действовать как основание, ход данной реакции определяется способом, которым соединяются реагенты. Когда эфирный раствор диазометана медленно добавляют к теплому раствору хлорангидрида, наблюдается выделение азота, и хлорметилкетон является основным продуктом.Для этой реакции требуется один эквивалент диазометана. Если добавить обратное, так что холодный раствор хлорангидрида медленно добавляют к избытку диазометана в холодном растворе эфира, снова наблюдается выделение азота; но расходуются два эквивалента диазометана. Продуктами реакции диазометана с HCl являются диазокетон и метилхлорид (газ).

Для проведения реакции Арндта-Эйстерта диазокетон разлагают в присутствии серебряного катализатора (обычно AgO ₂ или AgNO ₃ ) вместе с теплотой или световой энергией.Результирующая перегруппировка Вольфа генерирует кетен, который быстро реагирует с любыми гидроксильными или аминными реагентами, которые могут присутствовать в растворе.
Общие уравнения слева внизу показывают, что конечный продукт реакции Арндта-Эйстерта может быть карбоновой кислотой, сложным эфиром или амидом.

Три конкретных примера этой процедуры представлены справа от общих уравнений. Первые два примера представляют собой типичные реакции Арндта-Эйстерта. Переносимость других функциональных групп, таких как нитро, демонстрируется первым случаем; и второй пример показывает, что конфигурация мигрирующей группы сохраняется при перегруппировке.Другие реакции кетена, такие как [2 + 2] циклоприсоединение, могут иметь место в отсутствие гидроксильных растворителей или аминов. Реакция №3 является примером такой альтернативной реакции. Новые связи в цикладдукте окрашены в розовый цвет.

2. Реакции диазокетонов

Реакция Арндта-Эйстера является частным случаем более общего класса реакций диазокетона. Если предположить, что диазокетоны обычно разлагаются до ацилкарбенов, то можно представить себе множество последующих реакций, и многие из них были реализованы.На следующей диаграмме показаны некоторые из этих превращений, происходящие из формулы диазокетона в центре диаграммы. Молекулярный азот теряется в каждом случае, и путь перегруппировки Вольфа находится слева. Большинство других реакций отражают способность карбенов вставлять сигма-связи или присоединяться к двойным связям. Металлические катализаторы иногда используются для облегчения определенных реакций и могут связываться с карбенами с образованием карбеноидных промежуточных продуктов.
При нажатии на диаграмму будут показаны некоторые примеры этих реакций диазокетона.

Эта страница является собственностью Уильяма Ройша.
Комментарии, вопросы и ошибки следует
направлять по адресу [email protected].
Эти страницы предоставляются IOCD для оказания помощи в наращивании потенциала в области химического образования. 05.05.2013

Определение реорганизации от Merriam-Webster

re · ar · range · мент

| \ ˌRē-ə-ˈrānj-mənt

\

1

: акт перестановки чего-либо или кого-либо или состояние перестановки

перестановка мебели

изменения, которые потребуют некоторой перестройки расписания

… Подняв руки, чтобы поправить шляпу.- Генри Джеймс

2
химия

: сдвиг атомов или групп в молекуле соединения с образованием изомерного соединения.

Динамика перестройки генома в бактериальных популяциях

Образец цитирования: Дарлинг А.Е., Миклош И., Раган М.А. (2008) Динамика перестройки генома в бактериальных популяциях.PLoS Genet 4 (7):
e1000128.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128

Редактор: Дэвид С. Гутман, Университет Торонто, Канада

Поступило: 27 октября 2007 г .; Одобрена: 16 июня 2008 г .; Опубликовано: 18 июля 2008 г.

Авторские права: © 2008 Darling et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: дирхамов ОАЭ поддерживается грантом NSF DBI-0630765. IM поддерживается Региональным центром знаний по электронной науке, Университетом Этвеш, постдокторской стипендией Bolyai и грантом OTKA F 61730. MAR благодарит Австралийский исследовательский совет за поддержку, грант CE0348221.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Расположение генома оказывает глубокое влияние на фенотип организма.Расположение генома, вероятно, влияет на экспрессию гена [1], [2], [3] и может привести к полной потере функции гена, когда точка разрыва реаранжировки происходит внутри рамки считывания. Более того, известно, что перестройки влияют на сцепление и вносят генетическую несовместимость у эукариот [4]. Подобные эффекты подавления рекомбинации были предложены у прокариот [5], [6], чья способность к генетическому обмену между дивергентными таксонами была оценена только недавно [7]. У естественно компетентных микробов, которые подвергаются частой гомологичной рекомбинации, сами структуры генома могут быть лучшими индикаторами вертикального наследования, чем другие молекулярные признаки.

Наша способность измерять порядок генов и структуру хромосом претерпела несколько революций, начиная с тщательного изучения карт сцепления [8], позже переходя к прямому наблюдению под микроскопом, FISH, радиационно-гибридным методам секвенирования генома по парным концам и оптическим картированием [ 9], [10], [11], [12]. Непрерывное совершенствование измерительной техники дало откровения относительно характера и степени перестройки генома у организмов, от бактерий [13] до млекопитающих [14].

В кольцевых бактериальных хромосомах репликация ДНК делит кольцевую хромосому на два домена, называемых реплифорами. Репликация начинается, когда холоферменты ДНК-полимеразы отжигаются с ориджином репликации ( ori ). Затем два холоэнзима одновременно копируют кольцевую хромосому в противоположных направлениях, и первоначально холоферменты ДНК-полимеразы совместно локализуются в клетке в так называемой «фабрике репликации» [15]. Каждый холофермент копирует примерно половину хромосомы, и в конечном итоге они встречаются в макродомене Ter .Макродомен Ter охватывает большую часть хромосомы напротив начала репликации и содержит несколько сайтов ter , которые связывают белки, которые останавливают процесс ДНК-полимеразы [16]. В случаях, когда гомологичная рекомбинация имела место во время репликации, молекулярный аппарат XerCD разрешает димер хромосомы по сайту dif [17], [18]. Более того, преобладающий сайт терминации репликации, по-видимому, находится на сайте dif или рядом с ним [19].Мы называем каждую половину хромосомы, обозначенную номерами ori и dif , репликфорой. В дальнейшем мы будем использовать слово «конец» или фразу «конец репликации» для обозначения приблизительного местоположения сайта dif .

Секвенирование генома показало, что перестройки не происходят с равномерно распределенными конечными точками на кольцевых прокариотических хромосомах. Вместо этого обычно наблюдается поразительный паттерн инверсий с конечными точками, смещенными из-за начала и окончания репликации [20], [21], [22], [23].Было предложено несколько объяснений наблюдаемого паттерна, все из которых сосредоточены на природе репликации ДНК в кольцевых хромосомах.

Меж репликорная инверсия относится к хромосомной инверсии с одной конечной точкой в ​​каждой репликоре. Такие инверсии меняют местами относительную ориентацию начала и конца. Если конечные точки инверсии одинаково удалены от источника, то размеры репликоров остаются неизменными — так называемая «симметричная инверсия». Предыдущий анализ генома показывает, что инверсии обычно происходят с точками разрыва в противоположно ориентированных повторяющихся элементах [24], [25], [26].Когда происходит повреждение ДНК, механизм гомологически зависимой рекомбинации-репарации привлекает другую копию повторяющегося элемента в качестве матрицы для репарации. Инверсии, удаления и дублирования происходят, когда результирующее пересечение Холлидея неправильно разрешено. В то время как рекомбинация среди инвертированных повторов приводит к инверсиям, рекомбинация среди прямых повторов приводит к делеции. Когда рекомбинация между прямыми повторами происходит во время репликации, сегмент удаляется из одной хромосомы и дублируется в другой.

Репликация бактериальной ДНК, по-видимому, вызывает множество мутационных искажений и селективных сил в отношении их хромосомной архитектуры [27]. Считается, что хромосомы остаются небольшими из-за общей ошибки делеции [28]. Нитьспецифические олигомеры, такие как сайты × [29], помогают в репарации ДНК, в то время как KOPS / AIMS [30], [31] играют роль в репликации ДНК и сегрегации хромосом. Такие сигналы последовательности могут быть нарушены инверсиями в пределах одной репликоры, но не инверсиями между репликорами.Более того, обширный обзор геномов Salmonella в культуре предоставил доказательства того, что геномы с репликорами равного размера (сбалансированные репликооры) могут находиться под положительным отбором [32]. В настоящее время неизвестно, часто ли наблюдаются симметричные меж реплифорные инверсии просто потому, что они происходят чаще, чем другие перестройки (смещение рекомбинации), или же обычно встречаются другие паттерны перестройки, но сильно отобранные против [26].

Наблюдаемая частота перегруппировки относительно нейтрального замещения сильно различается у разных организмов.Частота наблюдаемых перестроек в современных геномах коррелирует с присутствием повторов, индуцированных мобильными генетическими элементами [26], [33]. Интересно, что мобильные генетические элементы (IS-элементы / транспозоны) также связаны с генерацией псевдогенов, редукцией генома и адаптивной эволюцией изменения ниши [34]. И крупномасштабная инверсия, и делеция обусловлены гомологичной рекомбинацией повторяющихся элементов. Взятые вместе, эти ассоциации предполагают, что методы прогнозирования эпизодов перестройки древнего генома могут быть в состоянии раскрыть историческую редукцию генома и переходы в экологической нише.

Исследования Yersinia выявили обширную геномную реаранжировку относительно конспецифических изолятов, и элементы IS были вовлечены в процесс реаранжировки. Недавняя доступность нескольких завершенных последовательностей генома Yersinia дает возможность исследовать закономерности и предубеждения, связанные с геномной перестройкой. Yersinia pestis сыграла роль возбудителя трех основных эпидемий чумы, которые вместе привели к миллионам смертей за последние два тысячелетия [35].Предыдущие молекулярные исследования показали, что Yersinia pestis является недавно появившимся клоном Y. pseudotuberculosis с предполагаемым расхождением менее 20 000 лет назад [36], хотя некоторая неоднозначность в порядке ветвления изолятов Y. pestis остается [37].

Учитывая патогенный образ жизни, популяционная динамика Y. pestis отличается от таковой для непатогенных микроорганизмов, и влияние динамики популяции на структуру генома заслуживает рассмотрения.После заражения человека-хозяина Y. pestis , вероятно, претерпевает значительный рост популяции. Передача к новому хозяину обычно опосредуется блоховым вектором, который может содержать лишь небольшое количество клеток Yersinia по сравнению с инфицированным человеком. Таким образом, современный Y. pestis , возможно, претерпел несколько циклов неограниченного роста популяции, за которыми последовали крайние узкие места в передаче. Фаза неограниченного роста может позволить генерировать клеточные линии с геномной перестройкой, которые впоследствии устраняются узкими местами передачи.Такая динамика популяции может способствовать увеличению наблюдаемой скорости перегруппировки.

Предыдущая экспериментальная работа охарактеризовала структуру генома у изолятов E. coli и Salmonella , чьи геномы были искусственно нарушены в лаборатории [38]. Наше исследование представляет собой первую попытку количественной оценки систематической ошибки отбора и рекомбинации, влияющей на расположение генома в естественно развивающейся популяции.

Результаты

История расположения генома

Yersinia

Мы применяем байесовский пробоотборник MCMC для исследования систематической ошибки отбора и рекомбинации, влияющей на перестройки генома в секвенированных изолятах Yersinia .На момент проведения этого исследования девять завершенных геномов Yersinia были общедоступными, они перечислены в таблице 1, и еще несколько были секвенированы для обеспечения качества проекта. Поскольку Yersinia pestis совсем недавно разошлись, только небольшое количество нуклеотидных замен было обнаружено в полностью секвенированных геномах [39], и попытки реконструировать филогению Yersinia , следовательно, были вынуждены объединить паттерны присутствия / отсутствия IS элементы и последовательности VNTR [37].

Попарное сравнение геномов Yersinia выявило большое количество геномных перестроек [25], [40], которые могут быть подходящими филогенетическими признаками. Поскольку крупномасштабная перестройка генома считается молекулярным признаком с низкой гомоплазией [41], невосприимчивым к латеральному обмену посредством гомологичной рекомбинации, даже небольшое количество перестроек может быть достаточным для разрешения топологии филогенетического дерева.

Выравнивание генома и размеры реплихора

Чтобы вычислить историю реаранжировки, мы требуем, чтобы геномы были закодированы как матрица перестановок со знаком, указывающая порядок и ориентацию гомологичных сегментов в каждом геноме.Мы использовали программное обеспечение для множественного выравнивания генома Mauve для идентификации и выравнивания 84 локально коллинеарных блоков (LCB), общих для 9 геномов Yersinia . Дифференциальное содержание генов среди линий Yersinia исключает девятистороннее выравнивание, которое полностью покрывает каждый геном. В среднем 81,5% каждого генома содержится в LCB, а остальные специфичные для клонов области находятся в областях точек останова. Области точки останова не могут быть однозначно отнесены к какому-либо соседнему LCB, и неопределенность относительно их размещения в предковых структурах генома вызывает соответствующую неопределенность в размерах предковых репликоров.

В то время как Y. pestis и Y. pseudotuberculosis разделяют большую часть своего генного содержимого, Y. enterocolitica имеет существенное различное содержание по сравнению с другими восемью таксонами [42]. Чтобы смягчить проблемы вывода, связанные с дифференциальным содержанием гена (см. «Методы»), мы удалили Y. enterocolitica из нашего анализа и вычислили выравнивание по оставшимся 8 таксонам, используя процедуру, описанную в разделе «Методы».

Расклад восьмерки Y.pestis и Y. pseudotuberculosis , показанные на рисунке 1, состоят из 78 LCB (79 без учета кольцевости генома), которые покрывают в среднем 93,3% каждого генома. Распределение длин LCB (рис. 2) выглядит геометрическим, что соответствует ожиданиям в рамках модели случайного разрушения Надо-Тейлора [14]. Для определения размеров предковых репликоров мы делим каждую из 78 областей контрольных точек пополам и назначаем каждую половину соседнему LCB. Начало и конец репликации в каждом геноме были назначены на основе предсказания консенсуса и гомологии (см. Методы).

Рис. 1. Выравнивание генома восьми изолятов Yersinia .

Полногеномное выравнивание восьми геномов Yersinia с использованием Mauve [77] выявило 78 локально коллинеарных блоков, законсервированных среди всех восьми таксонов. Каждая хромосома расположена горизонтально, и гомологичные блоки в каждом геноме показаны как регионы одинакового цвета, связанные в геномах. Области, которые инвертированы относительно KIM Y. pestis , смещены ниже центральной оси генома.Начало репликации в каждом геноме находится примерно в координате 1, а конечные участки diff находятся примерно на полпути через каждый геном, что отмечено серыми вертикальными полосами. Концы были идентифицированы путем сравнения последовательностей с Y. pestis KIM, где они были охарактеризованы с помощью обширного анализа последовательностей [25]. Рисунок создан Mauve, бесплатным программным обеспечением с открытым исходным кодом, доступным по адресу http://gel.ahabs.wisc.edu/mauve.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g001

Байесовский анализ филогении перегруппировки

Мы использовали модифицированную версию программного обеспечения BADGER 1.01b для выборки апостериорного распределения вероятностей филогенетических деревьев, частоты мутаций и историй расположения генома с использованием инверсий в качестве операций мутации. Модель рассматривает все события инверсии как равновероятные a priori , без явного предпочтения перегруппировок, которые поддерживают или улучшают баланс репликоров. Априорное распределение по длинам ветвей создает сильное предпочтение историям с меньшим количеством инверсий.Как и другие байесовские семплеры MCMC для филогенетики, используемый здесь метод создает начальное филогенетическое дерево с событиями мутаций, отображенными на ветвях, а затем неоднократно предлагает модификации текущей топологии дерева, истории мутаций и длины ветвей. Любые предлагаемые модификации принимаются с вероятностью, определяемой соотношением Метрополиса-Гастингса [43], [44]. Первоначально предложенная реконструкция истории инверсии обычно имеет очень низкую вероятность, и предлагаемые модификации обычно принимаются до тех пор, пока вероятность не достигнет локальных максимумов.Начальный период отбора проб обычно обозначается как пробы . Образцы, взятые во время прожига, отбрасываются, поскольку цепь Маркова еще не сходится к истинному апостериорному распределению.

Применительно к 78 Yersinia LCB мы запускали цепочки с 1 510 000 шагов предложения по модификации, отбрасывали первые 10 000 шагов каждой цепочки как «выгорание», а затем производили подвыборку каждые 50 шагов (подробности см. В разделе «Методы»). Результирующая апостериорная выборка состоит из 30 000 полных историй расположения генома.Каждая выбранная история содержит топологию дерева с событиями инверсии, отображенными на ветви. В общей сложности отобранные истории содержат 30 000 оценок топологии деревьев и 2 520 185 схем генома, из которых 2 280 185 предполагаемых предков, а 240 000 — современных. Визуализация апостериорного распределения деревьев с помощью SplitsTree v4 [45] выявляет небольшую топологическую неоднозначность в виде сети разбиения (рисунок 3). Топологической неоднозначности способствуют семь различных древовидных топологий с экономными историями инверсии 79 событий.Все семь экономных топологий различаются группировкой из изолятов Y. pestis . Тем не менее, Y. pestis оказались монофилетическими с подгруппами, которые согласуются с ранее опубликованными анализами генома [39]. Применение алгоритма максимальной экономии для восстановления филогении инверсии восстанавливает одну из семи экономичных топологий, идентифицированных BADGER, также с 79 инверсиями [46], [47]. Внутренние ветви клады Y. pestis очень короткие по сравнению с внешними ветвями, феномен, который может иметь множество объяснений, включая экспоненциальный рост популяции, деление популяции, предковую селективную зачистку или недавно увеличившуюся частоту мутаций, возможно связанную с динамикой популяции патогенов или расслабленный отбор в культуре.Следует отметить, что филогении SNP также имеют короткие внутренние ветви [39].

Рисунок 3. Консенсусная филогенетическая сеть Yersinia на основе инверсий.

Консенсусная филогенетическая сеть для восьми из Yersinia , перечисленных в таблице 1. Длина ветвей пропорциональна среднему количеству событий инверсии ветвей. Разделения с байесовской апостериорной вероятностью (Bpp)> 0,2 показаны черным, разделенные с Bpp между 0,1 и 0,2 — серым. Чтобы визуализировать сеть на Bpp 0.2, представьте себе удаление серых краев и выпрямление черных краев. Инверсионная филогения поддерживает кладу Y. pestis , а при Bpp 0.2 она поддерживает субклады, которые согласуются с филогенезом SNP [39]. Следует отметить, что внутренние ветви у Y. pestis короткие по сравнению с Y. pseudotuberculosis , что свидетельствует о быстром росте популяции, подразделении или других эффектах. Визуализация сети создана с помощью SplitsTree 4 [45].

https://doi.org/10.1371 / journal.pgen.1000128.g003

Визуализация истории инверсий

Для быстрого поиска закономерностей в истории перестройки генома Yersinia мы разработали 3D-видеосистему для визуализации серии событий перестройки. Апостериорная выборка истории инверсии содержит 30 000 выборок. Мы выбрали одну историю с максимальной апостериорной вероятностью и визуализировали серию событий перегруппировки на каждой ветви филогении с помощью специального программного обеспечения Java.Хромосома представлена ​​в виде тора с отмеченными положениями начала репликации и конца. Реплифоры, присутствующие в предковом узле дерева, имеют отчетливый цвет, левый репликор — синим, правый — зеленым. Интенсивность цветов изменяется по градиенту от исходной точки к конечной, так что сегменты около исходной точки в предке имеют темно-синий или зеленый цвет, а сегменты около конечной точки — светлые.

Дополнительные видеоролики S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 и S8 показывают историю инверсии вдоль каждой внешней ветви максимальной апостериорной оценки дерева .На видеороликах можно увидеть несколько поразительных паттернов перегруппировки, особенно те, которые представляют более длинные ветви, такие как ветвь, ведущая к Y. pestis

(видео S3). Во-первых, конечная точка остается в основном напротив начала координат на протяжении всей истории перегруппировки. Во-вторых, светлые сегменты, которые были около конца в структуре предкового генома, имеют тенденцию оставаться около конца. В-третьих, когда большие инверсии происходят в пределах одной реплики, за ними, кажется, быстро следует вторая инверсия, которая переворачивает первую.Теперь мы опишем статистику, чтобы количественно оценить значимость этих наблюдений, наряду с другими аспектами эволюции структуры генома, которые не так легко распознать с помощью визуализации.

Выбор для весов реплихоров

Когда конец репликации лежит напротив точки начала на кольцевой хромосоме, размеры репликор равны и геном считается сбалансированным. Если мы предположим, что начало координат находится в положениях 0 и 1 на круговой хромосоме, а конец сайта diff находится в некоторой позиции b , где 0 < b <1, мы можем количественно оценить степень дисбаланса как отклонение от идеального остаток средств: .Таким образом, идеально сбалансированный геном с b = 0,5 будет иметь нулевой дисбаланс, и дисбаланс увеличивается до 1, когда конец diff позиция сайта b приближается к 0 или 1.

Из 2 520 185 отобранных родовых расположений 77,9% расположений имеют реплику в пределах 20% от идеального баланса, а 88,5% находятся в пределах 30% от идеального баланса. Полное распределение баланса для предков можно почерпнуть из графика исторического конечного положения на рисунке 4A.Чтобы доказать, что предковое положение конца не может быть объяснено серией инверсий с произвольными конечными точками, мы выполнили 30 000 симуляций эволюции баланса репликор в геноме, который претерпевает инверсии с одинаково выбранными конечными точками. Сравнение с нулевой моделью предполагает, что она не может объяснить наблюдаемые данные (тест KS, медиана p -значение <10 ^-1 ). Даже когда смоделированное положение сайта конца dif ограничено диапазоном, наблюдаемым в современных геномах, нулевая модель не может объяснить наблюдаемый геномный баланс (тест KS, медиана p -value≈0.0001).

Рис. 4. Исторический баланс репликора в Yersinia .

Историческое положение конца сайта diff относительно происхождения (A) и историческая степень дисбаланса (B), наблюдаемая во всех отобранных схемах предкового генома восьми Yersinia , перечисленных в таблице 1. Гистограмма на (A) показывает репликофорный баланс всех отобранных предков и существующих геномов Yersinia . В (A) компоновка с равным размером репликора будет иметь конец в позиции 0.5, что указывает на идеальный баланс репликоров. Диаграмма показывает, что> 88% выбранных структур генома имеют репликоры в пределах 30% от идеального баланса. (B): гистограммы, показывающие степень дисбаланса для расположений, отобранных на ветвях, ведущих к современным геномам. Каждая гистограмма помечена названием соответствующего штамма. Геномы с идеально сбалансированными репликоорами имеют дисбаланс 0%, в то время как геном с началом и концом в одном и том же локусе будет иметь дисбаланс 100%. Многие, но не все, скупые истории инверсии имеют несбалансированное расположение генома у общих предков Y.pseudotuberculosis и Y. pestis Pestoides F, которые способствуют наблюдаемому дисбалансу в заднем распределении этих таксонов.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g004

Не все современные геномы сбалансированы. Y. pestis Pestoides F явно несбалансирован, с конечным положением 0,77 (дисбаланс 54%). Таким образом, мы можем спросить, не ограничивается ли наблюдаемый дисбаланс в структуре генома предков Y.pestis Pestoides F. линия. Рисунок 4B показывает дисбаланс, наблюдаемый на каждой внешней ветви филогении, с объединенными внутренними ветвями. Очевидно, что все линии претерпевают дисбаланс, хотя изолят Pestoides F за всю свою историю имеет большую долю несбалансированных геномов. Удивительно, но Y. pseudotuberculosis также демонстрируют высокую степень дисбаланса. Поскольку они являются сестринскими таксонами Pestoides F, дисбаланс можно объяснить дисбалансом у общего предка. Фактически, у общего предка часто предсказывается несбалансированный геном, а реконструкции со сбалансированным общим предком требуют промежуточных состояний дисбаланса на ветвях, ведущих к современному Y.psuedotuberculosis геномов.

Альтернативные объяснения необычного положения терминала у Y. pestis Pestoides F могут быть приняты, одним из таких объяснений является ошибка сборки. Поскольку сборка была проверена с использованием библиотеки Fosmid размером 40 КБ, мы не думаем, что это так (П. Чейн, личное сообщение). Другой альтернативой является то, что первичный конец репликации смещен в другое место в линии Y. pestis Pestoides F. Визуальный осмотр схемы перестановки для Y.pestis Pestoides F на Рисунке 1 демонстрирует несколько случаев локальных перекрывающихся инверсий, характерных для симметричной инверсии относительно конца (видимой как «веер» из пересекающихся линий). Если Pestoides F действительно переключился на новый первичный конечный сайт, это внесет некоторую ошибку в наш расчет распределения исторического баланса репликоров. Однако, поскольку только около 10% инверсий происходит на ветви, ведущей к Y. pestis Pestoides F, ошибка будет незначительной.Ошибка может привести к чрезмерной дисперсии расчетного распределения баланса и привести к более слабому явному смещению в сторону баланса репликоров.

Существенная двусмысленность существует в топологии филогенетического дерева, реконструированной по расположению генома Yersinia . BADGER обнаружил семь экономичных топологий, и в общей сложности было отобрано 48 уникальных топологий с числом инверсий от 79 до 87. Экономия имеет долгую историю как руководящая философия в эволюционном выводе, поэтому интересно знать, согласуются ли экономные реконструкции с нашими ожидание баланса репликоров в расположении генома.Средняя оценка дисбаланса оказывается немного меньше для скупых историй, а дисперсия намного ниже, как показано в таблице 2. Разница в балансе между скупыми и другими реконструкциями значительна (тест KS, p <2e-16) но разница небольшая (KS D = 0,016). Если мы считаем, что существует строгий отбор для сбалансированных геномов и инверсии, не влияющие на баланс, нейтральны, то экономные реконструкции кажутся несколько более благоприятными.

Симметричные инверсии

Предыдущие исследования показали, что репликация ДНК вносит рекомбинационный уклон, который способствует инверсиям с конечными точками, одинаково удаленными от начала репликации [22], [20], так называемым симметричным инверсиям.Учитывая наши предполагаемые истории инверсий, мы можем формально проверить наличие избытка симметричных инверсий. Для этого введем следующие обозначения. Пусть V будет упорядоченным набором инверсий, отображаемых на ветви дерева в выборочной реконструкции истории инверсии, и пусть v _i представляет инверсию i ^th . Затем мы определяем статистику симметрии для инверсий между репликорами как: (1) где O _L ( v _i ) — это расстояние между началом координат и левым концом i ^th межрепликорная инверсия, а O _L ( v _i ) — это расстояние между началом координат и правым концом инверсии.Таким образом, уравнение выражает расстояние между конечными точками инверсии и исходной точкой в ​​каждой реплике и вычисляет квадратичную разность расстояний. Уравнение 1 присваивает идеально симметричной инверсии нулевое значение, в то время как асимметричные инверсии принимают большие значения. Между прочим, статистика симметрии не зависит от выбора реплики, левой или правой.

Мы хотели бы знать, являются ли наблюдаемые инверсии более симметричными, чем ожидалось случайно. Для этого мы используем перестановку, чтобы сгенерировать распределение статистики симметрии, которое представляет собой нулевую гипотезу отсутствия симметрии.Мы вычисляем статистику симметрии по произвольным парам конечных точек левой и правой инверсии из межреплифорных инверсий в соответствии со следующим уравнением: (2)

Более формально, мы вычисляем нулевое распределение путем однородной выборки x и y без замены из набора возможных инверсий между репликами. O _L ( v _x ) представляет собой расстояние от начала координат до левой стороны инверсии x , а O _R ( v _y ) — расстояние от начало координат справа от инверсии y .Если бы конечные точки инверсии на двух репликаторах были независимы друг от друга, то мы не увидели бы значительного отклонения от нулевого распределения. Отклонение в сторону больших значений будет означать меньшее количество симметричных инверсий, чем ожидалось, тогда как отклонение в сторону меньших значений подразумевает более симметричные инверсии, чем ожидалось.

Сравнение статистики симметрии, генерируемой уравнениями 1 и 2, показывает, что внутри реплифорные инверсии с большей вероятностью будут симметричными, чем ожидалось случайно (тест KS, медиана p = 0.0001, среднее значение D = 0,47). Наблюдаемое статистическое распределение симметрии и соответствующее нулевое распределение показаны на рисунке 5.

Рис. 5. Межрепликфорные инверсии демонстрируют симметрию.

Межреплифорные инверсии демонстрируют большую симметрию относительно начала и конца, чем ожидалось в рамках нулевой модели. Симметрия для инверсий между репликорами была количественно определена уравнением 1 и сравнена с нулевым распределением. Нулевое распределение создается путем применения статистики перестановок в уравнении 2 к каждой из 30 000 выбранных историй перегруппировки.Объединенные апостериорные выборки и перестановки нанесены на график здесь, статистические тесты выполняются для каждой выборки.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g005

Эпизоды дисбаланса

Наш метод вывода не оценивает время событий, а только относительный порядок событий, поэтому мы не можем напрямую вывести фактическое количество времени, которое предковые геномы провели в сбалансированном состоянии. Однако, если мы определим состояние дисбаланса как процентное отклонение от идеального баланса, скажем, 20% -ное отклонение, то мы сможем количественно оценить количество эпизодов дисбаланса, которым подверглись организмы.Апостериорная оценка количества эпизодов дисбаланса, которым подверглись восемь Yersinia , составляет 3,26 ( σ = 1,82), не считая эпизодов, которые охватывают событие бифуркации на дереве. Апостериорное распределение показано слева на рисунке 6. Точно так же мы можем определить продолжительность эпизода дисбаланса как количество событий мутации (инверсий), которые произошли до того, как хромосома вернется в сбалансированное состояние. Продолжительность эпизодов дисбаланса, наблюдаемых в нашей задней выборке, показана справа на рисунке 6.

Рисунок 6. Эпизоды дисбаланса Yersinia .

Слева: Байесовское апостериорное распределение количества эпизодов дисбаланса, происходящих полностью на ветвях реконструированных филогений инверсии, по сравнению с пермутированными данными. Справа: апостериорное распределение продолжительности эпизода дисбаланса (в событиях мутации), наблюдаемое на ветвях, по сравнению с данными, переставленными, как описано в тексте. Из двух графиков мы можем сделать вывод, что переходы к дисбалансу менее часты, чем ожидалось в нулевой модели, и что эпизоды дисбаланса длятся дольше, чем ожидалось в нулевой модели.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g006

Если дисбаланс сильно выбран, мы можем ожидать, что эпизоды дисбаланса будут очень короткими и более частыми, чем ожидалось случайно, учитывая общее количество несбалансированных механизмов. . Чтобы определить, были ли количество и продолжительность эпизодов дисбаланса необычными, мы разработали тест перестановки, в котором состояния баланса вдоль ветвей реконструированных деревьев менялись случайным образом (подробности см. В разделе «Методы»).Перестановка дает нулевую модель организма, который свободно переходит в состояние равновесия и выходит из него, проводя в каждом состоянии такое же общее количество времени, что и геномы Yersinia .

Удивительно, но мы обнаружили полную противоположность нашим первоначальным ожиданиям. Количество эпизодов дисбаланса меньше, чем ожидалось в рамках нулевой модели, а эпизоды дисбаланса длиннее, чем ожидалось в нулевой модели. Шаблон устойчив к выбору определенного порога баланса, поскольку другие пороги до 40% дают аналогичные результаты.Объяснение может заключаться в том, что дисбаланс наносит лишь незначительный ущерб, или что узкие места передачи периодически фиксируют неоптимальное расположение генома в линиях Y. pestis , несмотря на их недостаток пригодности. После дисбаланса обычно происходит несколько инверсий, прежде чем баланс будет восстановлен. Учитывая, что хромосома Y. pestis засорена повторяющейся ДНК, это наблюдение согласуется с представлением о том, что выбор произвольной пары противоположно ориентированных повторов вряд ли приведет к инверсии, восстанавливающей баланс.Согласно такой гипотезе, количество инверсий, происходящих до восстановления баланса, должно возрастать с частотой противоположно ориентированной повторяющейся ДНК.

Длина инверсии

Предполагая, что на длину инверсии не действует смещение отбора или рекомбинации, распределение длин инверсии можно смоделировать как расстояние между двумя равномерно выбранными точками на окружности с окружностью 1. Однако 46,3% выбранных инверсий действуют в пределах одной реплики, и мы можно ожидать, что такие инверсии будут короткими по сравнению с инверсиями между репликорами.Хотя они не влияют на баланс, инверсии в репликоре действуют, чтобы изменить полярность сайтов x [29], KOPS / AIMS [30], [31], а также они изменяют ведущую / отстающую цепь A / T и G / Смещение [48], относительная плотность генов [27] и уровни экспрессии генов. Как показано на Рисунке 7, наблюдаемое распределение длин для инверсий внутри репликоров действительно указывает на то, что они короче, чем инверсии между репликорами. Однако мы ожидаем, что инверсии между репликорами будут длиннее, чем инверсии внутри репликоров по определению, потому что инверсии между репликорами должны иметь одну конечную точку в каждой репликоре.

Рис. 7. Апостериорное распределение длин инверсии у Yersinia .

Инверсии классифицируются как межрепликфорные (те, которые охватывают источник) и внутри репликоры. Наблюдаемые инверсии внутри репликоров имеют сильную тенденцию быть короткими, тогда как инверсии между репликорами имеют более равномерное распределение длины.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g007

Чтобы определить, являются ли инверсии внутри репликора значительно короче, чем инверсии между репликорами, мы разрабатываем нулевую модель длины инверсии, которая учитывает репликоры.Размеры реплихора изменяются по мере того, как положение конца сайта dif изменяется в ходе эволюции, таким образом, ожидаемая длина инверсий внутри реплифора и между репликорами изменяется. Мы предполагаем, что конечные точки инверсии распределены равномерно и что никакая инверсия не действует более чем на половину хромосомы, в противном случае более короткая комплементарная инверсия действует на другой стороне круговой хромосомы. Затем мы можем определить ожидаемую длину инверсии внутри репликора как: (3) (4) где 0 < b <1 - это положение конца сайта dif относительно точки начала репликации.Мы определяем аналогичную меру ожидаемой длины для инверсий между репликорами: (5)

Мы предоставляем подробный вывод этих уравнений в разделе «Методы», и значения, которые дает каждое уравнение для 0 < b <1, показаны слева на рисунке 8.

Рисунок 8. Инверсии короче, чем ожидалось.

Слева: ожидаемая длина инверсий внутри репликоров и между репликорами при условии, что конечные точки инверсии распределены равномерно. Ожидаемая длина изменяется в зависимости от положения конца сайта dif относительно точки начала репликации.В общем, ожидается, что инверсии внутри репликоров будут короче, чем инверсии между репликорами. Справа: отношение наблюдаемой длины инверсии к ожидаемой длине для всех выбранных инверсий внутри и между репликорами. Обе инверсии между репликорами и внутри репликор короче, чем ожидалось, но инверсии внутри репликоров намного короче, чем инверсии между репликорами.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g008

Зная ожидаемую длину для каждой инверсии, мы вычисляем отношение наблюдаемой длины к ожидаемой длине для каждой инверсии в апостериорной выборке.Распределение соотношений для инверсий внутри и между репликорами показано справа на рисунке 8. Оба класса инверсии короче, чем можно было бы ожидать при нулевой модели. Сравнение инверсий внутри репликоров и инверсий между репликорами показывает, что инверсии внутри репликоров намного больше, чем инверсии между репликорами (тест KS, медиана p = 0,002, среднее D = 0,41).

Выбор ориентации

ori и diff

Предыдущее исследование изолятов Salmonella продемонстрировало, что инверсия начала координат относительно конца не оказывает заметного влияния на приспособленность, пока сохраняется баланс [32].Несмотря на это, восемь из девяти геномов Yersinia имеют начало и конец в идентичной относительной ориентации, которую мы называем канонической конфигурацией OriDif (см. Таблицу 1). Конфигурацию можно легко увидеть на рисунке 1, заметив, что блоки, содержащие сайт dif (фиолетовый), смещены вверх в каждом геноме, кроме Y. pseudotuberculosis IP31758, как и блоки, содержащие исходную точку (крайние слева и справа на рисунке 1 ). Если канонический OriDif не предлагает избирательного преимущества перед неканонической конфигурацией, то наблюдение канонического OriDif можно смоделировать с помощью биномиального распределения.Под биномом вероятность наблюдения восьми из девяти геномов с каноническим OriDif составляет 0,018, что позволяет предположить, что предпочтение канонической конфигурации OriDif должно существовать. Геномы Y. pestis Angola и Y. pseudotuberculosis YPIII были завершены, пока эта рукопись находилась на рассмотрении, и они также демонстрируют каноническую конфигурацию OriDif, в результате чего общее число составило 10/11 и p <0,01. Следует отметить, что исследования паттернов мутаций у различных бактерий предполагают, что репликация заканчивается около самого сайта dif , несмотря на присутствие многих дополнительных сайтов ter [19].Хотя есть соблазн обобщить каноническую идею OriDif на другие бактериальные геномы, беглое изучение связанных сильно перестроенных геномов Shigella не выявило предпочтения канонической конфигурации OriDif.

То, что современные изоляты отдают предпочтение канонической конфигурации OriDif, предполагает, что предковая модель Yersinia также отдала бы предпочтение ей и, вероятно, также проводила бы заметно большее количество времени в такой конфигурации. Большинство перестроек генома у Yersinia (53.7%) представляют собой инверсии между репликами, которые меняют местами канонические и неканонические конфигурации OriDif. Таким образом, количество аранжировок с каноническим OriDif существенно не отличается от тех, которые имеют неканонический порядок.

Учитывая, что современные геномы стремятся к балансу и каноническому OriDif, мы можем ожидать ассоциации между балансом и OriDif, потому что инверсия, которая нарушает баланс, также должна изменить относительную ориентацию начала и конца. На левой панели рисунка 9 показан общий баланс компоновки в зависимости от конфигурации OriDif.Можно увидеть значительную связь между балансом и каноническим OriDif (тест KS, медиана p = 0,0015, среднее D = 0,4). Интересно, что когда устройства на внутренних узлах филогении сравниваются с расположениями ветвей, связь между каноническим OriDif и балансом оказывается более выраженной (Рисунок 9 справа). Однако сравнение баланса во внутренних узлах с каноническим OriDif и с разветвлениями с каноническим OriDif не демонстрирует существенной разницы (тест KS, медиана p = 0.67, среднее значение D = 0,33). Неспособность найти значительную разницу может быть из-за отсутствия мощности вывода, поскольку каждая выборка истории инверсии имеет только шесть внутренних узлов, из которых можно оценить распределение баланса. Дополнительные законченные последовательности генома Yersinia обеспечили бы большую статистическую мощность.

Рис. 9. Связь между балансом репликоров и относительной ориентацией ori и diff .

Слева: баланс для канонических и неканонических конфигураций OriDif.Справа: баланс в зависимости от того, расположены ли устройства на внутреннем узле или вдоль ответвления. Расположение внутренних узлов филогении кажется более сбалансированным, но только тогда, когда ori и dif находятся в канонической ориентации.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g009

Горячие точки перегруппировки

Самые скупые истории инверсии, выведенные BADGER, содержат 79 событий инверсии, однако в геномах Yersinia существует только 78 контрольных точек порядка генов.Ясно, что некоторые точки останова необходимо использовать повторно. Предыдущие исследования повторного использования точек останова [49], [50] обычно полагались на вывод о простом существовании повторного использования, а не на выявлении горячих точек реорганизации. Для этого мы должны сместить фокус с точек останова на конечные точки инверсии. Каждое событие инверсии обращает вспять один или несколько последовательных LCB. Левая сторона самого левого и правая сторона крайнего правого обращенного LCB составляют конечные точки инверсии. Таким образом, мы можем подсчитать, сколько раз данная граница LCB использовалась в истории инверсии.По определению, каждая граница LCB должна быть конечной точкой хотя бы одной инверсии, однако некоторые границы LCB могут использоваться более одного раза.

На рис. 10 показана апостериорная оценка использования отдельных границ LCB, нанесенная на карту в соответствии с их встречаемостью в геноме KIM Yersinia pestis . Выявляется поразительный паттерн, в котором конечные точки инверсии лежат проксимальнее точки начала репликации гораздо чаще, чем конца. Хотя инверсии с конечными точками около конца репликации действительно происходят, они сравнительно редки.

Рисунок 10. Горячие точки повторного использования точки останова в Yersinia существуют рядом с исходной точкой.

Вверху: количество аннотированных ORF элементов IS в неперекрывающихся окнах размером 40 Кбит / с генома Y. pestis KIM. Внизу: горячие точки повторного использования точки останова в Yersinia . 78 блоков имеют 156 конечных точек. Здесь представлены апостериорные оценки количества использований каждой конечной точки, причем конечные точки блока расположены в соответствии с их положением в геноме Y. pestis KIM.Конечные точки в пределах 1500 п.н. рибосомного оперона по крайней мере в одном из восьми геномов окрашены в красный цвет и отмечены «R», в то время как области конечных точек, содержащие аннотированный элемент IS, окрашены в черный цвет. Только одна область точки останова свободна от IS-элементов и рибосомных генов во всех геномах, что отмечено знаком «?». Вместе верхняя и нижняя панели демонстрируют, что мы редко наблюдаем инверсии с конечными точками, проксимальными к концу у Yersinia , несмотря на присутствие многочисленных IS элементов в этой области.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g010

Экспериментальные исследования перестройки генома у E. coli и Salmonella указали на существование хромосомных доменов около конца, которые не переносят инверсию конечные точки [38], называемые «недопустимыми зонами» или «неделимыми зонами». Yersinia , похоже, имеет аналогичное ограничение, видимое как область, непосредственно окружающая dif , имеющая 0 или 1 конечные точки инверсии.Альтернативным и очень правдоподобным объяснением является наличие AIMS проксимальнее конца репликации [31]. AIMS представляют собой поляризованные мотивы, которые направляют хромосомную сегрегацию во время деления клетки, и плотность таких мотивов увеличивается по мере приближения к сайту конца dif . Инверсия большого сегмента, богатого AIMS, может серьезно нарушить сегрегацию хромосом.

У других Enterobacteriacae частая хромосомная инверсия объясняется присутствием оперонов рРНК проксимальнее источника [51]; поскольку они консервативны в последовательности, эти опероны обеспечивают большой субстрат для гомологичной рекомбинации.Чтобы исследовать, участвуют ли опероны рибосомной РНК в большом количестве наблюдаемых перестроек, мы оценили присутствие оперонов рРНК в современных изолятах. На рисунке 10 конечные точки инверсии, которые имеют аннотированный ген рибосомной РНК в пределах 1500 п.н. от конечной точки, выделены красным и помечены буквой R. Хотя наиболее часто используемая конечная точка инверсии действительно граничит с рибосомным опероном, большинство часто используемых конечных точек нет. Вместо этого все, кроме одной из оставшихся конечных точек инверсии, имеют аннотированную транспозазу или ORF элемента IS в пределах 1500 пар оснований.Таким образом, разница в наблюдаемой скорости инверсии между рибосомными оперонами и мобильными элементами незначительна.

Если инверсии с конечными точками около конечной точки запрещены, то относительное конечное положение имеет ограниченный диапазон по отношению к началу координат. Таким образом, мы могли бы вернуться к вопросу о том, может ли наблюдаемое распределение баланса репликор быть объяснено нейтральной моделью инверсии. Как и в модели без ограничений, моделирование эволюции баланса репликоров, ограничивающее относительное положение конечных точек диапазоном [0.25,0.75] не могут объяснить наблюдаемое распределение репликофорного баланса (тест KS, медиана p -значение = 0,0001).

Инверсия Реверсия

Байесовское заднее распределение положения конца (Fig. 4A) показывает, что баланс репликоров в значительной степени поддерживался во время эволюции геномов Yersinia . Чтобы продемонстрировать, что наблюдаемый паттерн не является результатом инверсии с последующим немедленным возвратом с примерно такими же конечными точками, мы вводим следующую статистику.Как и выше, пусть V будет упорядоченным набором инверсий для всех ребер в дереве и пусть v _i относится к инверсии i ^th . Мы называем левую конечную точку инверсии v _i L ( v _i ), а правую конечную точку R ( v _i ). Обратите внимание, что координаты генома находятся в диапазоне от 0 до 1, так что 0≤ L ( v _i ) ≤ R ( v _i ) ≤1.Мы вычисляем следующую статистику для последовательных пар инверсий v _i и v _{i +1} : (6)

Значение в уравнении 6 является наименьшим, когда последовательные инверсии имеют идентичные конечные точки, и в этом случае вторая инверсия эффективно возвращает первую инверсию. Однако, поскольку наша байесовская модель перестройки генома отдает предпочтение историям с меньшим количеством общих инверсий, она лишь очень редко будет отбирать истории, содержащие последовательные инверсии, которые полностью компенсируют друг друга.Однако он будет беспристрастно производить выборку последовательных инверсий с близлежащими конечными точками. Такой паттерн инверсии может быть вызван неизвестной мутационной или селективной силой, которая способствует немедленной реверсии инверсий, такой как инверсия восстановления баланса.

На рисунке 11 сравнивается наблюдаемое распределение для уравнения 6 с перестановочным распределением, созданным путем объединения значений L ( v _i ) — L ( v _{i +1} ) с R ( v _j ) — R ( j _{i +1} ) для i , j равномерно отбирается без замены.Наблюдаемое распределение очень похоже на перестановочное распределение. Разница незначительна (тест KS, медиана p = 0,86, среднее D = 0,1), что указывает на то, что последовательные инверсии с почти равными конечными точками наблюдаются не чаще, чем можно было бы ожидать случайно.

Рис. 11. Тестирование того, восстанавливаются ли инверсии сразу после второй инверсии с примерно идентичными конечными точками.

Показано распределение статистики, описанное в уравнении 6, для последовательных инверсий в апостериорном распределении историй инверсий (темно-серый) и нулевого ожидания для случайно спаренных расстояний до конечных точек (светло-серый).Если смещение отбора или рекомбинации в пользу немедленной реверсии несбалансированных репликоров объясняет тенденцию к балансу, мы ожидаем увидеть последовательные инверсии с примерно равными конечными точками чаще, чем просто случайно. Разница между наблюдением и нулевым ожиданием незначительна (см. Текст).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g011

Обсуждение

Перестройка генома является универсальным процессом у прокариот [20], [22], многие из которых обнаруживают паттерны перестройки, подобные тем, которые наблюдаются у Yersinia .В то время как предыдущие исследования выявили закономерности перестройки в лабораторных условиях, наше исследование является первым подробным статистическим исследованием такого давления в естественной популяции. Геномы иерсиний представляют собой идеальную платформу для такого исследования, поскольку они недавно разошлись и претерпели небольшой поток генов.

Естественный отбор против смещения рекомбинации

Мы идентифицировали несколько паттернов инверсии, которые существенно отклоняются от нулевого ожидания, что все инверсии одинаково вероятны.Являются ли наши наблюдения результатом отбора против некоторых инверсий или существует рекомбинационная систематическая ошибка, из-за которой одни инверсии происходят чаще, чем другие? Наша статистика не может напрямую количественно оценить относительный вклад этих двух эволюционных сил.

Мы можем утверждать, что сбалансированные репликоры являются результатом положительного отбора от слабого до умеренного. Наше наблюдение о том, что эпизоды дисбаланса встречаются реже, чем ожидалось, и длятся дольше, чем ожидалось, может указывать на то, что в целом дисбаланс выбирается против, но когда он возникает, это лишь умеренно пагубно, поскольку баланс обычно не восстанавливается сразу.Случайный ослабленный отбор в итоге может быть функцией динамики популяции патогенов. С другой стороны, подобная картина может быть вызвана смещением рекомбинации, которое обычно предпочитает инверсии с конечными точками, равноудаленными от источника. Дисбаланс иногда может быть вызван инверсией с конечными точками, находящимися на неравном расстоянии от исходной точки, и, поскольку перебалансировка требует второй инверсии с конечными точками на неравном расстоянии от исходной точки, для восстановления баланса может потребоваться много инверсий.

Наше наблюдение, что Yersinia имеет каноническую конфигурацию OriDif, кажется, наиболее легко объяснимо естественным отбором. Смещение рекомбинации, приводящее к такому паттерну, должно было бы вызвать межрепликфорные инверсии, происходящие почти исключительно парами, и, насколько нам известно, не было описано правдоподобного молекулярного механизма, который мог бы достичь такого результата. Между прочим, если канонический OriDif является результатом отбора, это означает, что некоторые симметричные инверсии могут быть умеренно вредными для Yersinia .

Наше наблюдение, что инверсии с конечными точками около конечной точки встречаются гораздо реже, чем инверсии с конечными точками около начала координат, можно объяснить отбором против таких инверсий. Если Yersinia находится в условиях пониженного отбора по скорости роста, она может быть более терпима к инверсиям вблизи происхождения. Известно, что у близкородственных организмов, таких как E. coli , есть несколько сайтов связывания ter по всей половине хромосомы, окружающей конец сайта dif .Сайты ter являются поляризованными мотивами, так что они останавливают процесс реплисомы только в одном направлении [16]. Таким образом, инверсия внутри репликора с участием сайта ter может привести к летальному нарушению репликации ДНК. Аналогичный пагубный эффект можно было бы предвидеть при инвертировании сегментов, богатых AIMS.

Мы также можем рассматривать смещение рекомбинации как объяснение избытка инверсий с конечными точками вблизи начала координат. Известно, что у быстрорастущих бактерий есть множественные репликационные вилки [52].Если области рядом с источником репликации существуют в большем количестве копий, они могут быть более склонны к перегруппировке, но большее количество копий также приведет к более высокому эффективному размеру популяции ( N _e ), что, как можно ожидать, нейтрализует эффект более высокая частота мутаций. В любом случае на рис. 10 наблюдается резкий сдвиг от высокой скорости инверсии к низкой скорости при удалении от начала координат. Хотя существует правдоподобный механизм отбора против инверсий внутри репликоров проксимальнее конца, рассуждения не применимы к инверсиям между репликорами, которые составляют более половины всех инверсий.Учитывая, что скорость инверсии примерно в три раза выше около начала координат, кажется вероятным, что дополнительные неизвестные силы смещения рекомбинации или отбора играют роль в снижении скорости инверсии около конца.

Аранжировки как филогенетические знаки

Филогении с точным расположением генома потенциально могут обеспечить эталонную топологию филогенетического дерева, на основе которой могут быть проверены гипотезы рекомбинации, преобразования генов и латерального переноса генов.Chaisson и др. [53] продемонстрировали, что тщательно отфильтрованные маркеры микроинверсии млекопитающих могут использоваться в качестве бинарных признаков, которые формируют идеальную филогению, и подобный подход может быть предусмотрен для микробов. Хотя Chaisson и др. утверждают, что реаранжировки являются признаками с низкой гомоплазией, основываясь на способности их (тщательно отфильтрованных) данных пройти тест с четырьмя гаметами, три мешающих фактора препятствуют таким простым подходам к филогенезу реаранжировки при изучении полных структур генома.Во-первых, перегруппирующие мутации часто перекрывают друг друга, создавая взаимозависимость и, таким образом, препятствуя четкому представлению мутаций как двоичных символов. Во-вторых, об изменчивости на уровне популяции в расположении генома сообщалось как у микробов [54], так и у млекопитающих [55], подразумевая, что эффекты сортировки по клонам могут давать деревья расположения генома, которые не соответствуют дереву видов. Наконец, программная перестройка [56], [57] не только вводит изменчивость на уровне популяции, но может многократно инвертировать один и тот же хромосомный сегмент, что потенциально может приводить к частой гомоплазии.

Следует подчеркнуть, что анализы на основе ПЦР идентифицировали смеси геномных структур в лабораторных культурах Y. pestis [54]. Если перестройки генома, такие как симметричные инверсии, являются почти нейтральными мутациями, можно ожидать, что их частота в популяции приблизительно соответствует модели Райта-Фишера. Таким образом, популяции с высокой скоростью реаранжировки могут иметь более одного расположения генома. Насколько нам известно, никаких свидетельств мутаций программной перестройки у Y.pestis , который может вызывать частую реверсию и гомоплазию при крупномасштабных мутациях реаранжировки. Такие эффекты наблюдались как часть изменения фазы у других микробов [56].

Сопутствующие работы

Хотя были разработаны богатые стохастические модели эволюции нуклеотидных последовательностей, сравнительно мало усилий было направлено на разработку стохастических моделей эволюции структуры генома. Известно, что инверсии влияют на множество геномов, включая митохондрии [58], пластиды [59], [60] и бактерии.Однако мутационные процессы, такие как транспозиция или сегментная дупликация и потеря [61], также могут приводить к геномной перестройке и могут иметь особенно сильное влияние на порядок эукариотических и митохондриальных генов. Будущие усилия по моделированию эволюции структуры генома, несомненно, должны решить проблему дупликации / потери.

Хотя бактерии обычно являются унихромосомными, у них также есть плазмиды и другие короткие кольцевые хромосомы, которые могут играть важную роль в перестройке генетического материала.Поэтому байесовский метод MCMC для филогении мультихромосомного генома также был бы желателен. Парные модели мультихромосомной перестройки через кольцевые промежуточные соединения были недавно получены, хотя и не в байесовском контексте [62], [63], [64].

Паттерны перегруппировки, полученные в результате нашего исследования, должны оказаться ценными в качестве руководства для филогенетических выводов, когда сигнал истории инверсии становится насыщенным. Изученные здесь геномы Yersinia , похоже, находятся на грани насыщения, поскольку было обнаружено семь экономных топологий.Так же, как модели кодонов и гамма-распределенная гетерогенность по скорости помогли филогенетическому выводу о нуклеотидах, модели реаранжировки, которые явно признают, что не все структуры генома одинаково вероятны, могут быть полезны для устранения неоднозначности филогенетического сигнала в насыщенных историях инверсии. Парное исследование компоновки эукариотических геномов продемонстрировало предпочтение определенных типов событий реаранжировки [65], и методы, подобные нашим, вероятно, могут быть расширены для идентификации отбора по расположению из филогений мультихромосомных эукариотических геномов.

Нефилогенетическая, попарная модель перестройки с помощью инверсии ранее использовалась для исследования предпочтения исторического баланса репликоров у бактерий [66]. Используя случайно смоделированные структуры генома в качестве основы, авторы приходят к выводу, что исторический баланс репликоров в значительной степени поддерживался у множества бактерий, но не у всех. Наш байесовский метод улучшает их модель, позволяя более строго оценивать степень статистической достоверности и неопределенности при реконструкции истории инверсии.Более того, наш метод позволяет избежать систематической ошибки при исследовании возможных историй инверсии. Распределение, полученное методом Ajana и др. , не является однородным для столь же экономных сценариев инверсии, но искажено в пользу конкретных событий мутации. В некоторых случаях разница между их распределением выборки и равномерным распределением может расти экспоненциально ([67], раздел 5.2).

Методы

Вычисление выравнивания генома

Мы использовали алгоритм Progressive Mauve [68] для вычисления выравнивания девяти геномов, перечисленных в таблице 1.Анализ полученного сопоставления показал, что Y. enterocolitica 8081 содержит существенные различия в содержании генов по сравнению с другими геномами Yersinia , при этом только 81,5% от среднего генома Yersinia сохраняется среди всех девяти таксонов. Современные байесовские модели расположения генома не моделируют прирост и потерю генетического материала, поэтому мы удалили Y. enterocolitica 8081 из дальнейшего анализа.

Расстановка восьми Y.pestis и Геномы Y. pseudotuberculosis были сконструированы с использованием параметров mauveAligner по умолчанию. Полученные LCB были проверены с помощью средства просмотра выравнивания Mauve, и минимальный вес LCB был скорректирован до значения, которое исключает LCB, состоящие только из повторяющихся элементов (вес LCB 600).

Затем мы вычислили полное выравнивание с минимальным весом LCB 600 и обработали полученный файл выравнивания XMFA в матрицу перестановок в формате BADGER (набор данных S1).

Байесовское моделирование перестроек генома

Мы применяем байесовскую модель перестройки генома путем инверсии, реализованную в программе BADGER [69].BADGER моделирует геномные инверсии как непрерывный марковский процесс, происходящий вдоль ветвей неукорененного филогенетического дерева, которое связывает организмы. Все события инверсии моделируются как равновероятные a priori . Это позволяет нам рассчитать вероятность истории перестройки генома, отображенной на дереве, с учетом дерева и частоты мутаций, см., Например, [70].

Длины ветвей измеряются как количество мутаций на ветке, при этом длины моделируются с использованием экспоненциального распределения.Среднему значению экспоненциального распределения дается гипер-априор, который создает сильное предпочтение для более коротких общих длин ветвей и, таким образом, назначает более высокие апостериорные вероятности экономичным историям инверсии.

BADGER выборки из совместного апостериорного распределения топологий деревьев, историй инверсии и скоростей мутаций с использованием метода Монте-Карло с метрополисом, связанного с цепью Маркова, также известного как MCMC с параллельным темперированием [71]. Точный вывод с использованием методов MCMC требует сходимости цепей Маркова и адекватного перемешивания.В общем, пробоотборники MCMC для перестройки генома, по-видимому, смешиваются очень медленно, потому что поверхность вероятности может быть неровной, а хорошие механизмы предложения для перехода между пиками могут не существовать. Использование подогреваемых параллельных цепей (муфта Метрополис) может в некоторой степени облегчить проблему [72]. Метод параллельного темперирования сначала рассматривает байесовское апостериорное распределение как распределение Больцмана при единичной температуре. Вероятность определенного состояния X в распределении Больцмана определяется как (7) где Δ G ( X ) — это свободная энергия, e — натуральное число и T — температура.Поскольку мы говорим о гипотетических энергиях и температурах, мы опускаем Больцмана или газовую постоянную ( k или R ) в формуле. Установка T = 1 приводит к определению свободной энергии состояния как (8)

После определения свободной энергии для каждого состояния параллельная закалка запускает несколько цепочек с разными температурами, ненагретая цепь имеет температуру 1, нагретые цепи имеют более высокие температуры. Все цепочки сходятся к своему собственному предписанному распределению Больцмана, но иногда они меняют состояния.Свопинг регулируется правилом Metropolis ([43]; отсюда и название MCMC, связанный с Metropolis), которое гарантирует, что свопинг не изменяет сходимость к предписанным распределениям. Поверхность вероятности является плоской при высоких температурах, что обеспечивает быстрое перемешивание в пространстве состояний, в то время как переключение между ненагретыми и нагретыми цепями допускает возможность того, что ненагретая цепь может перепрыгнуть из одного локального минимума в другой.

В нашем приложении к LCB Yersinia мы использовали схему соединения Metropolis с температурами от 1 до 1.18 для обеспечения надлежащего перемешивания. Сравнение прогонов с 3, 5, 19 и 49 нагретыми цепями показало, что только прогоны с 19 или 49 нагретыми цепями обнаружили все семь экономных топологий в пределах 500 000 шагов MCMC. Наблюдение за графиком логарифма правдоподобия и сравнение прогонов позволяет предположить, что цепи сходились и смешались в достаточной степени, чтобы поддержать выводы, описанные в настоящей работе.

Чтобы сделать вывод об устройстве генома предков, мы модифицировали код BADGER C ++ для записи истории инверсии в каждой точке подвыборки.Было реализовано дополнительное программное обеспечение для суммирования полученных задних образцов расположения генома. Все программное обеспечение доступно по адресу http://bioinformatics.org.au/barphlye.

Укоренение дерева

Несмотря на исключение Y. enterocolitica из филогении реаранжировки генома, он остается потенциально полезной внешней группой для укоренения дерева с использованием молекулярного признака, такого как нуклеотидные замены. Бушуют споры о правильном методе вывода о филогенезе с использованием больших наборов данных по нескольким генам или полному геному.Рекомбинация, латеральный обмен, сортировка клонов и другие естественные процессы могут привести к филогенетическому сигналу, который широко варьируется от гена к гену. Одной из попыток признать и смягчить влияние таких эффектов является недавно предложенный подход фактора конкордантности, который предоставляет метод для вывода доли генома, подтверждающей данную гипотезу вертикального наследования [73].

Мы применяем статистику соответствия байесовского дерева для оценки поддержки альтернативных корней филогенетической сети, показанной на рисунке 3.Анализ 30 случайно выбранных генов дает апостериорный фактор конкордантности , равный 19,4 (из 30, 90% доверительный интервал [10], [28]), поддерживающий корень на ветви, ведущей к Y. pseudotuberculosis IP31758. Альтернативное укоренение на ветви, ведущей к Y. pseudotuberculosis IP32768, дает коэффициент согласованности всего 7,5 с 90% доверительным интервалом [0,17]. Анализ факторов конкордантности предполагает, что рекомбинация и сортировка по клонам у Yersinia вызвали противоречивый филогенетический сигнал по всему геному, но что большая часть отобранных генов поддерживает укоренение Y.псевдотуберкулез IP31758. Недавно сообщалось, что такая частая крупномасштабная гомологичная рекомбинация является общей чертой у других Enterobacteriacae [74], [75]. Интересно, что дерево конкордантности слабо поддерживает размещение Y. pestis Pestoides F в качестве сестринских таксонов Y. pestis KIM, тогда как инверсионная филогения помещает линию Pestoides F как предков оставшихся Y. pestis с высокими показателями. уверенность.

Длины LCB и баланс реплихора

Хотя мы отбросили Y.enterocolitica из-за наличия дифференцированного содержания генов восемь оставшихся геномов также содержат определенное клоноспецифическое содержание. Различия в содержании генов означают, что наблюдаемые длины LCB различны в каждом современном геноме. Более того, области точек останова могут содержать контент, зависящий от происхождения. Чтобы сделать вывод о балансе предковых репликоров с помощью модели, в которой отсутствуют прирост и потеря генов, необходимо было назначить длину каждому LCB и учесть часть каждой хромосомы в областях точек разрыва.Мы использовали метод эталонного генома, основанный на Y. pestis KIM, который представляет собой медианное значение с точки зрения размера генома среди восьми изученных геномов Yersinia . Мы присвоили половину каждой области контрольной точки соседнему LCB в Y. pestis KIM и приняли полученные длины LCB как репрезентативные для всех геномов. В среднем 6,7% каждого современного генома находится в областях точек разрыва, а размер генома отклоняется от Y. pestis KIM на +/- 3%. Таким образом, использование нами эталонного генома вносит некоторую ошибку в оценки размеров предковых репликоров.В худшем случае ошибка может достигать 10%, но средняя ошибка достаточно мала, чтобы не повлиять на основные выводы, описанные здесь.

Определение источника и конечной точки

diff Зона

Ориджин и конец репликации в Y. pestis KIM были ранее идентифицированы как встречающиеся на приблизительно 1 п.н. и 2,324 Мбит / с, соответственно [25]. Здесь конец относится к точке на хромосоме, где перекос олигомера, специфичного для цепи, резко смещается в сторону противоположной цепи.Другие сообщили, что изменение перекоса олигомеров обычно происходит около конца сайта dif [19], и поэтому мы используем сайт изменения перекоса цепи в качестве заместителя для истинного сайта dif . Сайты ori, и dif были отнесены к другим геномам на основе гомологии с Y. pestis KIM. Предсказанный сайт dif находится в середине большого сегмента 140 т.п.н., консервативного среди всех геномов Yersinia с идентичностью последовательностей> 95% (см. Рисунок 1).Точно так же предсказанное происхождение находится в середине сегмента длиной 53 т.п.н., консервативного среди всех Yersinia с идентичностью последовательностей> 95%.

Сравнение наших прогнозов происхождения и окончания с предсказаниями, сделанными автоматизированной системой предсказаний [76], показывает, что наши предсказания почти во всех случаях совпадают с предсказаниями, сделанными автоматизированной системой в пределах 1 кбит / с. Несоответствие возникает в предсказании конца для Y. pestis

. Несоответствие, по-видимому, является результатом многочисленных недавних перегруппировок, которые нарушили сигнал о перекосе олигомера, специфичного для цепи, и, в свою очередь, запутали автоматизированную систему.

Оценка значимости в тестах Колмогорова-Смирнова

Мы сообщаем об анализе 30 000 выборок из апостериорного распределения историй инверсии. Мы предполагаем, что Yersinia имеет одну истинную эволюционную историю, и что не более одной из предполагаемых историй представляет истинную историю. Таким образом, сравнивая распределения интересующих величин, мы делаем это для каждой выборки, используя тест Колмогорова-Смирнова. Мы берем медианное значение p из 30 000 тестов в качестве оценки значения p , которое было бы получено, если бы тест был применен к одной истинной истории.Мы сообщаем средние значения D как средние оценки разницы между целевыми распределениями.

Тестирование перестановок для эпизодов дисбаланса

Мы используем случайную перестановку, чтобы генерировать нулевое распределение количества и продолжительности эпизодов дисбаланса. Образец дерева с инверсиями, отображенными на его ветвях, имеет одно расположение генома для каждого листа (всего 8), одно расположение для каждого внутреннего узла (всего 6) и некоторое количество промежуточных расположений вдоль каждой ветви дерева.Для каждой выборки в апостериорном распределении деревьев и историях инверсии мы присваиваем значения дисбаланса промежуточным расположениям генома в выборке. Для каждой ветви данной выборки дерева мы генерируем перестановочное распределение, случайным образом перетасовывая значения дисбаланса промежуточных структур генома на этой ветви. Затем мы подсчитываем количество переходов к дисбалансу и от него вдоль исходной ветви и вдоль ветви с переставленными значениями. Таким образом, случайно переставленные данные имеют одинаковое общее количество сбалансированных и несбалансированных состояний с одинаковыми значениями баланса, но любые кластеры несбалансированных состояний будут равномерно случайными.

Наш подход перестановки игнорирует фактические события инверсии, но генерирует случайные перестановки с теми же общими значениями баланса. Невозможно построить случайную перестановку значений дисбаланса путем перетасовки самих событий инверсии, поскольку перекрывающиеся события инверсии имеют строгие ограничения порядка, и нарушение этих ограничений часто приводит к изменению значений дисбаланса. Более того, стратегия, которая делает выборку событий инверсии единообразно случайным образом, не даст набора значений баланса, согласующихся с набором, который мы хотим переставить.

Ожидаемая длина инверсий внутри и между репликориями

Предположим, что конечные точки инверсии находятся в позициях x и y , при этом x , y ∈ [0,1]. Длину инверсии можно выразить как функцию min {| x — y |, 1− | x — y |}, поскольку инверсия происходит на круговой хромосме длиной 1, а для любой инверсии, превышающей 0,5, существует дополнительная инверсия с более короткой длиной.Если предположить, что конечные точки инверсии распределены равномерно, то ожидаемая длина является интегральным средним от функции min {| x — y |, 1− | x — y |} над соответствующей областью A : (9) где | A | обозначает размер области. В случае инверсий внутри репликоров область A представляет собой объединение двух квадратов, очерченных пунктирной линией на фиг. 12, в случае инверсий между репликорами A представляет собой объединение двух прямоугольников.Для простоты мы опускаем все детали интегрирования, и результирующие уравнения для инверсий внутри репликоров и инверсий между репликами приведены в уравнениях 4 и 5, соответственно.

Рис. 12. Расчет ожидаемой длины инверсии.

Ожидаемую длину инверсий внутри реплик и между репликами можно вычислить как интегральные средние функции min {| x — y |, 1− | x — y |} над соответствующими областями. Здесь 0 < b <1 - это конец сайта diff .См. Текст для более подробной информации.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000128.g012

Многоступенчатый механизм активации перестройки иммунной системы

Реферат

Перестройка локусов иммунных рецепторов — это процесс, контролируемый развитием, который происходит исключительно в лимфоидных клетках. Мы использовали стабильную систему трансфекции в пре-B-клетках, чтобы показать, что метилирование ДНК вызывает недацетилирование гистона, метилирование гистона h4 (K9), устойчивость к ДНКазы I и сильное ингибирование как транскрипции, так и рекомбинации.Поразительно, что эта репрессия сохраняется в делящихся клетках даже после удаления исходных метильных групп, ответственных за ее создание, но в этом состоянии перегруппировка теперь может быть вызвана повторным ацетилированием локальных гистонов с использованием препарата Трихостатин А. Та же самая комбинация деметилирования и гистона. ацетилирование также необходимо для активации транскрипции и рекомбинации зародышевой линии из эндогенного локуса κ in vivo . Эти результаты показывают, что регулирование перегруппировки осуществляется посредством многослойного синергетического процесса.

Развитие лимфоцитов характеризуется сборкой рецепторов B- и T-клеточного антигена. Генные сегменты вариабельной области фланкированы консервативными сигнальными последовательностями рекомбинации (RSS), которые служат субстратом для двух лимфоид-специфических белков, Rag1 и Rag2 (1–3), которые вместе с другими ферментами опосредуют реаранжировку. Несмотря на то, что все эти реакции реаранжировки опосредуются универсальными RSS на ДНК и выполняются одним и тем же набором ферментов, рекомбинация происходит запрограммированным, специфичным для клеточного типа, локус-последовательным образом (3, 4), что позволяет предположить что это регулирование осуществляется на уровне доступности локуса.

Хотя мало что известно о механизмах, которые подавляют незапланированную перестройку генов, одним из основных участников этого процесса должно быть метилирование ДНК (5). В случае локуса κ мыши есть четкие доказательства того, что деметилирование фактически предшествует и может быть необходимо для нормальной рекомбинации in vivo во время развития В-клеток (6). В соответствии с этой концепцией было продемонстрировано, что метилирование ДНК может ингибировать перестройку как в культуре клеток (7, 8), так и у трансгенных мышей (9), возможно, за счет своего влияния на ацетилирование гистонов и структуру хроматина (10, 11).

Мы использовали простой субстрат рекомбинации в стабильной системе трансфекции, чтобы продемонстрировать, что изначально присутствие метилирования ДНК служит для установления репрессированной структуры хроматина, характеризующейся нечувствительностью к ДНКазы I и локальным деацетилированием гистона h5, а также метилированием h4 на лизине 9. Удаление это метилирование само по себе не снимает блокировки рекомбинации, но оно делает локус более восприимчивым к модификации гистонов, которая может активировать транскрипцию и рекомбинацию.Эндогенный локус κ также подчиняется аналогичному механизму контроля. Эти результаты служат моделью для понимания как общей репрессии реаранжировки в нелимфоидных клетках, так и многослойного последовательного процесса раскрытия хроматина, который происходит во время лимфоидной дифференцировки.

Материалы и методы

Плазмида. pMX-RSS-EGFP был сконструирован путем вставки фрагмента размером 0,8 т.п.н., содержащего усиленный GFP (EGFP), выделенный из pEGFP (CLONTECH), фланкированный 12- и 23-RSS, в pMX (12).EGFP находится в обратной ориентации относительно 5 ‘LTR. Вектор вируса мышиных стволовых клеток (MSCV) -Rag2-IRES-Rag1 был любезно предоставлен Сарой Черри (Гарвардская медицинская школа, Кембридж, Массачусетс). Кассету Rag2 сайта входа в рибосому (IRES) -Rag1 субклонировали в MSCV (13) и разрезали с помощью Eco RI / Sac I, гидролизата, который удаляет промотор фосфоглицераткиназы, управляющий геном neo.

Культура клеток и лекарственная обработка. Пре-B-клетки мыши 38B9 (14) обрабатывали 10 нг / мл трихостатина A (TSA) (Sigma) в течение 24 ч перед исследованием степени рекомбинации V (D) J или локальной транскрипции.p53 ^{— / —} и p53 ^{— / —} / Dnmt1 ^{— / —} фибробласты (описаны в Вспомогательных материалах и методах , веб-сайт PNAS, www.pnas.org) обрабатывали 50 нг / мл TSA в течение 24 часов для изучения транскрипции κ зародышевой линии и двухцепочечных разрывов (DSB), индуцированных Rag.

Метилирование in vitro и трансфекция.Клетки 38B9 (1 × 10 ⁷ ) стабильно подвергали электропорации с метилированной или неметилированной линеаризованной плазмидной ДНК, как описано (ссылка 15 и вспомогательные материалы и методы , ). p53 ^{— / —} и p53 ^{— / —} / Dnmt ^{— / —} клетки были ретровирусно инфицированы вектором pMSCV-Rag2-IRES-Rag1 5 h. как описано (16), а через 24 часа добавляли TSA (50 нг / мл) еще на 24 часа.

Рекомбинационный анализ. Геномная ДНК (1 мкг) была подвергнута амплификации ПЦР с использованием праймеров P1 и P3 для первого цикла и P2 и P4 для второго цикла (см. Рис. 2 и таблицу 1, которые опубликованы в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS. ), которые способны усиливать только молекулы, подвергшиеся рекомбинации V (D) J.

Анализ чувствительности к ДНКазе. Клетки (2 × 10 ⁸ ) из клонов 38B9, содержащих метилированный EGFP, смешивали с равным количеством клеток из неметилированных или деметилированных клонов.В некоторых экспериментах от трех до семи отдельных клонов из каждой категории смешивали вместе для создания пулов. Анализ чувствительности к ДНКазе выполняли, как описано (17).

Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP). Анализ ChIP выполняли, как описано (18), с использованием кроличьих поликлональных антител, направленных против ацетилированного гистона h5 (10 мкг на 60 мкг мононуклеосомной ДНК) или антител против Me-h4 (K9) (20 мкл на 10 мкг мононуклеосомной ДНК). (Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк), а затем протеин A-сефароза (5 мг на 60 мкг мононуклеосомной ДНК) (Sigma).Молекулы EGFP были амплифицированы с помощью P6 и P7, α-актин с α-actinR и α-actinL и β-актин с β-actinR и β-actinL ( вспомогательных материалов и методов, и таблица 1).

ОТ и ПЦР, опосредованная лигированием (LM-PCR). Суммарная РНК была собрана из клеток (TRIzol, Sigma) и подвергнута обратной транскрипции (Promega), и RT-PCR анализ нереаранжированных молекул EGFP был выполнен с использованием P1 с P8 и P2 с P7 (см. Фиг. 2 , верхний ). Анализ транскрипции зародышевой линии κ с помощью ОТ-ПЦР проводили с использованием праймеров GLκ1 и GLκ2 для обнаружения 0.РНК размером 8 т.п.н., а также GLκ3 и GLκ4 для РНК размером 1,1 т.п.н. Продукты генов β-актина (с использованием β-actin1 и β-actin2, таблица 1) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Aprt) (с использованием Aprt1 и Aprt2) использовали для измерения количества кДНК в реакциях RT-PCR. Оба условия ОТ-ПЦР были такими же, как описано выше для гена β-актина в анализе ChIP. Молекулы РНК Rag1 и -2 измеряли с использованием Rag1L и Rag1R, Rag2L и Rag1R (таблица 1). LM-PCR проводили, как описано (ссылка 19 и Вспомогательные материалы и методы ), с использованием праймеров BW1 и BW2 (таблица 1).Геномная ДНК (2 мкг от RAG-инфицированных фибробластов p53 ^{— / —} и p53 ^{— / —} / Dnmt1 ^{— / —} фибробластов) с последующим линкерным лигированием. ПЦР с использованием праймеров Lκ1 и BW3 для обнаружения сигнальных концов Jκ1 (см. Рис. 6 и таблицу 1). Продукты ПЦР анализировали с помощью саузерн-блоттинга с использованием радиоактивного олигонуклеотида Lκ5 в качестве зонда.

Рис.2.

Метилирование ДНК репрессирует перестройку репортерного гена EGFP.Показана схематическая диаграмма реаранжировки репортерного гена EGFP. Стрелки показывают расположение праймеров. Геномная ДНК из um-cl1, dm-cl2 и m-cl3 была амплифицирована первым набором праймеров (1; 3), а затем вложенным набором праймеров (2; 4) для обнаружения реаранжировки. Ген α-актина использовали в качестве контроля количества вводимой ДНК. Аналогичные результаты были получены для всех метилированных, неметилированных и деметилированных клонов, использованных в этом исследовании.

Рис. 6.
Обработка

TSA активирует эндогенный ген κ.( A ) Карта локуса κ, на которой показаны промоторы (стрелки) транскриптов зародышевой линии размером 1,1 т.п.н. (5 ‘) и 0,8 т.п.н. (3’), положения Jκ1–5 и константная область ( Cκ). Показан анализ ОТ-ПЦР p53 ^{— / —} и p53 ^{— / —} / Dnmt1 ^{— / —} фибробластов для зародышей Igκ 0,8 и 1,1 кб. транскрипты -линии (GLκ) с (+) или без (-) обработки TSA. Ген Aprt мыши используется в качестве контроля для этих экспериментов.( B ) p53 ^{— / —} или p53 ^{— / —} / Dnmt1 ^{— / —} клетки с трансфицированными экспрессирующими векторами Rag или без них, и векторы экспрессии Rag обрабатывались анализировали с помощью ОТ-ПЦР на экспрессию Rag1 и Rag2 с использованием β-актина в качестве контроля. LM-PCR (см. Диаграмму) использовали для обнаружения DSB на Jκ1 RSS с использованием α-актина в качестве контроля содержания ДНК. Саузерн-блот-анализ с использованием четырех различных чувствительных к метилу рестрикционных ферментов показал, что область гена κ неметилирована в клетках Dnmt1 ^— (данные не показаны).

Результаты

Метилирование ингибирует перестройку репортерного гена EGFP. Для изучения рекомбинации V (D) J мы использовали репортерную плазмиду, состоящую из последовательности гена EGFP, фланкированной двумя RSS. Эта ДНК была метилирована in vitro с использованием метилаз Hha I и Hpa II, и как модифицированные, так и немодифицированные конструкции стабильно котрансфицировали индивидуально в линию пре-B клеток 38B9, которая экспрессирует активности Rag1 и Rag2.Саузерн-блот-анализ ДНК из репрезентативных колоний (см. Вспомогательные материалы и методы ) показал, что в большинстве случаев метилированная конструкция оставалась модифицированной, неметилированный EGFP оставался неизменным (рис. 1 B ), и эти образцы были стабильными на протяжении многих поколений. . Однако мы обнаружили, что несколько клонов, содержащих метилированный EGFP, подверглись обширному спонтанному деметилированию после нескольких месяцев роста в культуре (рис. 1 B ; см. Таблицу 2, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). .

Рис.1.

Статус метилирования интегрированного репортерного гена EGFP. ( A ) Карта репортерного гена рекомбинации EGFP. EGFP (пунктирная линия) имеет обратную ориентацию по отношению к 5 ′ LTR (темная линия), окруженный 12 RSS (открытый треугольник) и 23 RSS (закрашенный треугольник). Отмечены сайты рестрикционных ферментов для Eco RI (R), Hpa II (Hp), Hha I (Hh), Nco I (N) и Sac I (S). Линия под картой рестрикции представляет фрагмент Eco RI– Nco I, используемый в качестве радиоактивного зонда.( B ) Паттерн метилирования трансфицированного репортерного гена EGFP. Репортерный ген EGFP метилировали in vitro с использованием метилаз Hha I и Hpa II, и как модифицированные, так и немодифицированные конструкции котрансфицировали плазмидой, несущей селективный ген neo ^r , в клетки 38B9. Колонии, устойчивые к неомицину, увеличивали и затем использовали для подготовки ДНК для анализа саузерн-блоттингом. ДНК из неметилированных (um), метилированных (m) и деметилированных (dm) клонов (cl) расщепляли Nco I / Eco RI с или без Hha I и Hpa II и подвергали блоттингу. гибридизация с использованием радиоактивного зонда EGFP ( A ).Аналогичные результаты были получены для всех неметилированных (26), метилированных (25) и деметилированных (7) клонов, использованных в этом исследовании. Хотя этот анализ исследует только состояние метилирования подмножества сайтов в областях EGFP, все сайты Hpa II и Hha I, показанные на рисунке, были проанализированы с помощью чувствительной к метилу ПЦР и показали, что их метилирование составляет <10%. в деметилированных клонах.

Для измерения способности каждого типа ДНК претерпевать реаранжировку in vivo были разработаны специальные олигонуклеотиды для обнаружения реаранжированных молекул с помощью ПЦР-анализа (рис.2). Неметилированные трансфицированные гены подвергаются высокой степени активной рекомбинации. Напротив, реаранжированные продукты не были получены с ДНК из клонов, трансфицированных метилированными конструкциями EGFP (рис.2 и таблица 2), а анализ разведения показал, что мы могли обнаружить реаранжировку на уровнях, в 10000 раз меньших, чем наблюдаемые для неметилированной ДНК ( данные не показаны). Поскольку только ≈10% остатков CpG ( сайтов Hpa II и Hha I) на тестовом векторе были фактически метилированы в этих экспериментах, возможно, что этот эффект еще сильнее in vivo , где плотность метилирование может быть выше.Эти результаты согласуются с предыдущими экспериментами в других системах, которые также показывают, что метилирование ДНК ингибирует рекомбинацию (7-9).

В отличие от этой сильной корреляции, реаранжировки не наблюдались в клонах, которые подверглись спонтанному деметилированию (Fig. 2 and Table 2). Чтобы продемонстрировать, что интегрированная деметилированная ДНК сама по себе не утратила своей внутренней способности подвергаться перестройке, мы амплифицировали репортерный ген EGFP из одной из деметилированных линий с помощью ПЦР, клонировали продукты в новый плазмидный вектор, а затем повторно трансфицировали эту ДНК в неметилированной форме. обратно в клетки 38B9 дикого типа.Аналогичные трансфекции также проводили с тотальной геномной ДНК, выделенной из dm-clone2, с использованием селекции Neo для идентификации тех клеточных колоний, которые приобрели область вектора EGFP. После обеих этих процедур восстановления репортерная ДНК EGFP претерпела перестройку примерно на том же уровне, что и исходные неметилированные векторы (рис. 7, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Это представляет собой четкое доказательство того, что деметилированные матрицы не претерпели никаких изменений в первичной последовательности, которые могли бы предотвратить перестройку, и функционально демонстрирует, что репрессивное состояние может поддерживаться, даже если ДНК потеряла способность восстанавливать репрессию.В свете этих результатов мы заключаем, что неспособность спонтанно деметилированных молекул EGFP подвергаться перегруппировке является результатом структурных особенностей хроматина, которые изначально были созданы с помощью метильных групп на трансфицированной ДНК и, по-видимому, остаются на месте даже после деметилирования.

Чувствительность к ДНКазеI трансфицированных репортерных генов рекомбинации EGFP. Поскольку предыдущие исследования продемонстрировали, что метилирование ДНК играет роль в установлении неактивного хроматина (20–23), мы затем проанализировали чувствительность DNaseI для каждого субстрата.Чтобы иметь возможность напрямую сравнивать активные и неактивные матрицы в одном эксперименте, клетки из метилированных клонов смешивали с клетками из неметилированных или деметилированных клонов перед приготовлением ядер и обработкой ДНКазой. Расщепленную ДНК экстрагировали и разрезали с помощью Eco RI / Sac I в присутствии или в отсутствие Hha I, чтобы различать метилированные и неметилированные молекулы EGFP, а затем подвергали блот-гибридизации (фиг. 3 A ). .Как показано на фиг. 3 B , неметилированная экзогенная ДНК более чувствительна к ДНКазе I, чем ее метилированный аналог. Однако ДНК, которая изначально была метилирована и находится в закрытой конформации хроматина, остается недоступной для ДНКазы I даже после удаления самих метильных групп. Аналогичные результаты были получены при использовании пулов метилированных или деметилированных клонов (данные не показаны и таблица 2). Эти результаты могут объяснить недоступность этих шаблонов для Rag1 и Rag2 и, следовательно, их неспособность подвергнуться перегруппировке.

Рис.3.

Чувствительность ДНКазы I к метилированным, неметилированным и деметилированным репортерным генам EGFP. ( A ) Клетки из метилированных EGFP-содержащих клонов смешивали с клетками из неметилированных или деметилированных клонов перед получением ядер и последующей обработкой DNaseI. Расщепленную ДНК дополнительно разрезали с помощью Eco RI / Sac I и Hha I, чтобы различать метилированные и неметилированные молекулы EGFP, и подвергали блот-гибридизации с использованием радиоактивного зонда, показанного на фиг.1 А . ( B ) График (на основе фосфорного изображения блоттинга) показывает чувствительность к метилированным, неметилированным и деметилированным клонам к репортерному гену EGFP DNaseI. Аналогичные результаты были получены при использовании пулов метилированных или деметилированных клонов (данные не показаны и таблица 2).

Модификация гистонов и рекомбинация V (D) J. Затем мы проверили, может ли модификация гистонов (24–28) быть ответственна за эффекты метилирования, наблюдаемые в вышеупомянутых экспериментах.С этой целью мы исследовали состояние ацетилирования гистона h5 нуклеосом в области EGFP с помощью анализа ChIP. Сначала мононуклеосомы были выделены из стабильно трансфицированных клеточных линий, а антиацетилированные (Ac) h5 антитела были использованы для специфического осаждения высокоацетилированной фракции. ДНК выделяли из несвязанных и связанных мононуклеосом, взятых из отдельных трансфицированных клонов, и тестировали на содержание последовательности с помощью ПЦР (фиг. 4 A ).

Рис.4.

Гистоновая модификация репортерных генов EGFP.Полученные микрококковой нуклеазой мононуклеосомы из отдельных клонов um-cl1, dm-cl2 и m-cl3 или из пулов (pl) неметилированных (um), деметилированных (dm) и метилированных (m) клонов осаждали антителами, направленными против ацетилированных клонов. гистон h5 ( A ) или метилированный гистон h4 (K9) ( B ). ДНК выделяли из несвязанных и связанных фракций и подвергали количественной ПЦР с использованием праймеров (6; 7) (см. Фиг. 2) для области EGFP и для β- и α-актина мыши в качестве контролей.Показаны три концентрации (1-, 3- и 9-кратные). ChIP Ac-h5 также проводили на объединенных колониях (данные не показаны). ( C ) Данные в A и B были перерисованы в графической форме. Для экспериментов с Ac-h5 степень обогащения (связанный / несвязанный) нормирована на полученную для гена α-актина в каждом типе клеток, тогда как эксперименты с Me-h4 (K9) нормированы на полученную для β- ген актина. Следует отметить, что идентичные результаты были получены для области LTR вектора.

Для каждой клеточной линии мы сначала показали, что последовательности гена β-актина обогащены по сравнению с неэкспрессируемым геном (α-актин) (29). Когда трансфицированные последовательности были проанализированы в тех же фракциях мононуклеосомной ДНК, мы обнаружили, что неметилированные копии EGFP были сильно обогащены (в 20 раз) в связанной фракции (рис. 4 C ) и, следовательно, должны быть упакованы в открытую структуру хроматина. . Напротив, метилированные последовательности EGFP были в гораздо меньшей степени обогащены для ацетилирования.Аналогичные результаты были также получены, когда этот эксперимент проводился на объединенных, а не на отдельных колониях (фиг. 4 C и таблица 2).

Затем мы провели ChIP на мононуклеосомах, выделенных из трансфицированных клеток 38B9, с использованием антитела, специфичного для Me-h4 (K9), которое связано с неактивными генами (30). В этом случае неактивный ген α-актина сильно обогащен связанной фракцией по сравнению с последовательностями β-актина. Поразительно, что мы обнаружили, что неметилированный трансген EGFP упакован нуклеосомами, несущими относительно неметилированный h4 (K9) (например, меньше, чем α-актин), тогда как в этом анализе метилированная ДНК обогащена Me-h4 (K9) (рис.4 B и C ). Следует отметить, что эти эффекты метилирования ДНК на модификацию гистонов, вероятно, не просто косвенное следствие локальной транскрипции, потому что даже нетранскрибируемые бактериальные последовательности ведут себя аналогичным образом при введении в клетки в культуре (данные не показаны). Таким образом, вместе взятые, наши результаты показывают, что присутствие метилирования ДНК напрямую влияет на состояния локальных модификаций гистонов, которые, в свою очередь, могут быть вовлечены в модуляцию доступа к аппарату реаранжировки.

В свете этих результатов можно было ожидать, что последовательности EGFP будут подвергаться переупаковке в активную структуру нуклеосом после спонтанного деметилирования. ChIP анализ, однако, ясно показывает, что основные гистоны, присутствующие на этой ДНК, фактически сохраняют свое неактивное состояние, при этом h5 является относительно неацетилированным, а h4 все еще сильно метилирован по остатку лизина 9 (Fig. 4 C ). Таким образом, способность подвергаться перестройке, по-видимому, напрямую коррелирует со структурой хроматина.

Активация реорганизации TSA. Тот факт, что метилированная ДНК упакована в структуру нуклеосомы, содержащую недеацетилированные гистоны, предполагает, что эта особенность участвует в предотвращении перестройки генов. Чтобы проверить, так ли это (8, 29), мы обрабатывали клетки ингибитором гистондеацетилазы, TSA (31), а затем исследовали степень рекомбинации. Когда TSA был добавлен к клеткам, содержащим конструкции EGFP, ни неметилированная, ни метилированная ДНК не пострадали.Неметилированная ДНК сохраняла свою нормальную степень реаранжировки, тогда как метилированная ДНК оставалась устойчивой к рекомбинации (фиг. 5 A ) даже после добавления высоких концентраций TSA (данные не показаны). Поразительно, однако, что ДНК-субстраты, которые подверглись спонтанному деметилированию, ответили на TSA по крайней мере 5000-кратным увеличением перегруппировки, достигая уровня, аналогичного тому, который наблюдается для исходных неметилированных клонов ДНК (рис. 5 A и таблица 2). Эти результаты показывают, что неактивное состояние может сохраняться в течение многих поколений в культуре даже в отсутствие исходных метильных групп, ответственных за его установление.

Рис.5.
Обработка

TSA активирует перестройку и транскрипцию деметилированного репортерного гена EGFP. ( A ) Геномную ДНК получали из клеток um-cl1, dm-cl2 и m-cl3, которые обрабатывали TSA или без него (10 нг / мл в течение 24 часов), а затем амплифицировали с вложенными праймерами (1; 3 и 2; 4, см. рис. 2), детектирующие перегруппированные (Re) молекулы. α-Актин использовали в качестве контроля для измерения количества введенной ДНК. Аналогичные результаты были получены для других неметилированных (4), деметилированных (6) и метилированных (11) клонов (таблица 2).( B ) RT-PCR анализ транскрипции EGFP в неметилированных, деметилированных и метилированных клонах с (+) или без (-) обработки TSA. Амплификацию проводили с вложенными праймерами (1; 8 и 2; 7, см. Рис. 2). Ген β-актина использовали в качестве контроля в этих экспериментах. Аналогичные результаты были получены для других неметилированных (4), деметилированных (6) и метилированных (5) клонов (таблица 2). ( C ) dm-cl2 клонировали одноклеточно с получением dm-cl2 ‘. Обработанные dm-cl2 ‘клетки выращивали в отсутствие TSA, субклонировали и затем исследовали на транскрипцию EGFP с помощью RT-PCR, как указано выше.

Активация транскрипции TSA. Поскольку конструкция EGFP содержит интактный вирусный промотор LTR, мы смогли определить, подвергаются ли репортерные гены, используемые в нашем эксперименте, также синтезу РНК в сочетании со способностью претерпевать реаранжировку. Когда мы использовали анализ RT-PCR (рис. 5 B ), мы обнаружили сильный сигнал от неметилированных репортерных последовательностей, протестированных в нескольких различных индивидуальных клонах (таблица 2). Напротив, транскрипция метилированной ДНК сильно подавлялась (≈5000 раз).Мы также проанализировали ряд клонов, которые в разной степени подверглись спонтанному деметилированию. Поразительно, но эти шаблоны оставались практически полностью неактивными (рис. 5 B ). Однако с добавлением TSA транскрипция была увеличена до контрольных уровней (рис. 5, , B, ), хотя это лекарство почти не влияло на метилированные матрицы (таблица 2). Когда обработанные клетки выращивали в отсутствие TSA в течение многих поколений, все полученные субклоны сохраняли высокий уровень активности (рис.5 C ), предполагая, что само деацетилирование гистонов может потребоваться для поддержания неактивного состояния. Более того, эти находки также подтверждают, что исходная репрессия, наблюдаемая для этого трансгена, должна быть вызвана метилированием ДНК, а не результатом внутреннего сайленсинга в сайте интеграции.

Чтобы проверить, ведет ли себя эндогенный локус κ аналогичным образом, мы использовали линию клеток фибробластов p53 ^{— / —} / Dnmt1 ^{— / —} , разработанную в нашей лаборатории ( Вспомогательные материалы и Методы ).В отличие от фибробластов дикого типа или p53 ^{— / —} , почти все (95%) остатки CpG в этих клетках неметилированы (данные не показаны), даже если эти клетки фактически произошли от эмбрионов, которые должны подверглись метилированию во время имплантации (см. Вспомогательные материалы и методы ). Как показано на фиг. 6 A , транскрипция κ-зародышевой линии (GLκ) не могла быть обнаружена ни в одном типе клеток, даже при использовании чувствительного анализа RT-PCR.Напротив, синтез РНК как из проксимального (транскрипт 0,8 т.п.н.), так и из дистального вышестоящего промотора (транскрипт 1,1 т.п.н.) (32) сильно индуцировался обработкой TSA, но только из неметилированных клеток (рис. 6 A ). Это может представлять собой более общий феномен, поскольку другие метилированные гены, по-видимому, ведут себя аналогичным образом (33).

В свете этих результатов мы затем спросили, может ли эндогенный локус κ также быть доступным для реаранжировки в нелимфоидных клетках.С этой целью мы ввели векторы экспрессии для генов Rag1 и Rag2 в клетки p53 ^{— / —} и p53 ^{— / —} / Dnmt1 ^{— / —} и с помощью ОТ-ПЦР мы подтвердили, что эти гены действительно экспрессируются после трансфекции (фиг. 6 B ). Потенциал реаранжировки определяли путем анализа DSB на Jκ1 RSS с использованием LM-PCR. Поразительно, но специфические DSB наблюдались исключительно из неметилированных матриц и только после обработки TSA.Таким образом, подобно репортерным трансгенам, эндогенный локус κ, по-видимому, синергетически репрессируется как метилированием ДНК, так и деацетилированием гистонов. Взятые вместе, эти эксперименты подтверждают наше первоначальное наблюдение, что неактивное состояние может поддерживаться в растущих клетках даже в отсутствие метилирования.

Обсуждение

Наши результаты предполагают, что метилирование ДНК обеспечивает репрессию реаранжировки посредством нескольких независимых механизмов.С одной стороны, наличие метилирования явно вызывает локальные изменения в модификации гистонов (22, 23), и это может быть, отчасти, причиной того, что метилированные матрицы ДНК упаковываются в недоступную для ДНКазыI конформацию (29). С другой стороны, нет никаких сомнений в том, что деацетилирование гистонов само по себе не может объяснить все эффекты метилирования ДНК, потому что TSA-опосредованное реацетилирование не могло индуцировать транскрипцию и реаранжировку на метилированной матрице, хотя было показано, что такое же точное лечение быть эффективным после самопроизвольного удаления исходных метильных групп (рис.5 и 6). Интересно отметить, что хотя TSA работает в основном путем ингибирования гистондеацетилазы, этого может быть достаточно, чтобы вызвать более полные изменения в структуре хроматина, индуцируя чувствительность к ДНКазе (29) и химически предотвращая метилирование гистона h4 лизина 9. Поскольку большая часть RSS не содержат остатков CpG, маловероятно, что метилирование действует напрямую, препятствуя связыванию факторов реаранжировки.

Наши результаты не только предоставляют информацию для понимания того, как реаранжировка ингибируется в нелимфоидных клетках, но также проливают свет на механизмы, которые могут быть использованы для освобождения локусов рецептора антигена от репрессии, чтобы позволить запрограммированную рекомбинацию в нужное время во время лимфоидного развития.Область Jκ, например, и метилируется, и упаковывается в неактивную гистоновую структуру перед перестройкой (6, 27), и каждое из этих препятствий, по-видимому, должно быть устранено во время развития В-клеток. Наши эксперименты с трансгенами также предполагают, что этот процесс может осуществляться по крайней мере двумя независимыми механизмами, и вполне вероятно, что это также имеет место в случае in vivo во время нормального развития, поскольку репрессия эндогенного локуса κ также осуществляется посредством синергетический механизм (рис.6).

Уже было продемонстрировано, что иммуноспецифические энхансеры необходимы для деметилирования рецепторных локусов (15, 34–36), и вполне вероятно, что энхансеры также играют роль в локальном деацетилировании гистонов Ig (10, 24, 37, 38). ). Действительно, эти цис-действующие последовательности, как было показано, важны как для ацетилирования, так и для перегруппировки, независимо от их способности вызывать деметилирование (10, 24, 39), и даже принудительного недостаточного метилирования самого по себе недостаточно для индукции рекомбинации (16).Напротив, в нескольких исследованиях было высказано предположение, что лечение препаратами, которые ингибируют гистондеацетилазы, может помочь преодолеть ингибирующие эффекты метилирования ДНК, но в этих случаях авторы не исключают строго возможность того, что рекомбинация действительно произошла на небольшом количестве неметилированных молекулы (8, 25). Следует отметить, что хотя наши исследования показывают, что и деметилирование, и ацетилирование гистонов необходимы для перегруппировки, неясно, как эти события происходят in vivo .Конечно, возможно, что сначала происходит деметилирование. Однако столь же вероятно, что опосредованное энхансером ацетилирование гистонов является начальным триггером и что за этим следует удаление метильных групп (40), что затем приводит к рекомбинации.

Одним из наиболее интересных открытий в этой статье является то, что трансфицированная ДНК способна поддерживать неактивную структуру хроматина даже в отсутствие исходных сигналов, участвующих в установлении репрессированного состояния.В присутствии метилирования ДНК локальные гистоны изменяют свое состояние модификации посредством реакций, которые, вероятно, опосредуются комплексами связывающих метил белков, которые привлекают ферменты модификации гистонов, такие как деацетилазы (23, 41) и метилазы (42). Поскольку у клеток уже есть простой механизм для поддержания метилирования ДНК посредством репликации, легко понять, как неактивное состояние хроматина сохраняется от одного поколения клеток к другому. Неожиданно наши результаты показывают, что недоступная конформация хроматина, изначально заданная присутствием метильных фрагментов, на самом деле может сохраняться сама по себе, даже после того, как метильные группы были удалены.Это открытие предполагает, что должен существовать независимый от метилирования механизм для генокопирования эпигенетических состояний на вновь образованных молекулах ДНК во время репликации. Хотя это явление наблюдалось у других организмов (43, 44), это первая демонстрация поддержания хроматина у млекопитающих.

Благодарности

Мы благодарим доктора Сару Черри за вектор MSCV-Rag2-IRES-Rag1 и сотрудников наших лабораторий за стимулирующие обсуждения. Работа поддержана грантами Израильской академии наук (Ю.B. и HC), Немецкий Израильский фонд (для YB), Национальные институты здравоохранения (для YB и HC), Пятая рамочная программа качества жизни Европейского сообщества (для YB) и Израильский фонд исследований рака (для HC ).

Сноски

• ↵ ‡ Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: yberg {at} md2.huji.ac.il.

• Сокращения: RSS, сигнальная последовательность рекомбинации; EGFP, улучшенный GFP; TSA, трихостатин А; LM-PCR, ПЦР, опосредованная лигированием; ChIP, иммунопреципитация хроматина; DSB, двухнитевые разрывы.

• Copyright © 2003, Национальная академия наук

Перестройка гена тяжелой цепи иммуноглобулина при остром лимфобластном лейкозе у взрослых выявляет преимущественное использование проксимальных вариабельных сегментов JH | Кровь

Мы использовали 6 нормальных образцов BM взрослых и 6 нормальных образцов PB взрослых для амплификации перегруппировок V _H — (D) -J _H с помощью радиоактивно меченной ПЦР с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле высокого разрешения (PAGE).Было обнаружено, что продукты амплифицированной ДНК являются высокополиклональными, и равномерно распределенные полосы ДНК или лестницы (в среднем по 14 видимых полос на лестницу) наблюдались как в нормальном BM, так и в PB (Рисунок 1), причем каждая полоса внутри лестницы отличалась от следующей на приблизительно 1 пара оснований (п.н.). Общее количество перегруппировок V _H — (D _H ) -J _H было оценено как равное или превышающее общее количество наблюдаемых полос ПЦР, поскольку можно ожидать, что каждая полоса несет более одного клона. (общая оценка: более 472 для нормальных образцов BM и более 525 для нормальных образцов PB).Полосы были количественно оценены денситометрией, и данные были объединены для каждой лестницы, чтобы получить относительную частоту использования для каждого семейства V _H (Таблица 2; Рисунок 2A-B). Интенсивность полос для семейств V _H 3 и V _H 4 всегда была выше, чем у других амплификаций V _H (особенно в BM), составляя от 50% до 70% всего использования V _H . За V _H 1 следуют полосы от средней до сильной интенсивности (12% всех продуктов), за исключением PB6 (менее 4%).Напротив, полосы V _H 2, V _H 5 и V _H 6 были постоянно слабыми (6%, 6% и 2,6% от всех продуктов соответственно) и часто визуализировались только после длительного воздействия. В нормальном BM последние семейства V _H всегда располагались в следующем порядке: V _H 2 было больше, чем V _H 5, что было больше, чем V _H 6, и V _H 5 иногда было немного сильнее в PB (PB1 и PB5) по сравнению с V _H 2 и V _H 6.Использование V _H 6 показало самые слабые сигналы во всех элементах управления. Средние профили показаны на рисунке 2D. Общий порядок ранжирования использования семейства V _H для обычных BM и PB в целом соответствовал (V _H 3 был больше, чем V _H 4, который был больше, чем V _H 1, который был больше, чем V _H 2, который был больше, чем V _H 5, который был больше, чем V _H 6), с ожидаемыми теоретическими профилями, рассчитанными на основе сегментов зародышевой линии (перегруппированных или функциональных) (Таблица 1; Рисунок 2D), которые имеют такой же рейтинг заказ, за ​​исключением V _H 1, который, как ожидается, будет сильнее, чем V _H 4.

Чтобы сравнить профили использования семейства V _H с ожидаемыми теоретическими профилями, первые были выражены в виде отношения по отношению ко второму, причем отношения, близкие к 1, указывают на сходство (рис. 3A-B). Нормальный BM имел меньшие отличия от зародышевой линии V _H (перегруппируемая или функциональная) для семейств V _H от V _H 1 до V _H 5, причем различия не превышали 2,2 раза в обоих направлениях. V _H 6 Использование было в 3–4 раза ниже ожидаемого, хотя исходные значения для фактического и ожидаемого использования были низкими (менее 2,5%). Нормальный PB соответствовал зародышевой линии V _H (функциональный) хорошо, с наибольшим отклонением от ожидаемого, происходящим при V _H 5 (3,2 раза), хотя все исходные значения были небольшими (менее 5%). Нормальный BM и нормальный PB также сравнивали друг с другом, и было обнаружено, что профили схожи, с наибольшими отклонениями, возникающими при V _H 6 (образцов BM было 8.В 3 раза ниже), хотя опять же все исходные значения были низкими и составляли менее 5%.

.